中国北方异位性皮炎与SPINK5、SCCE基因多态性关系及异位性皮炎流行病学的研究

摘要

本文分三部分论述了中国北方异位性皮炎与SPINK5、SCCE基因多态性关系及异位性皮炎流行病学的研究。 研究对象与方法： 一、SPINK5基因多态性与异位性皮炎相关性的研究 (一)、研究对象： 1、病例组即异位性皮炎组。为2005年3月至2007年1月在中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊就诊的沈阳及周边地区患者91例。诊断标准为williams标准。所有病例于就诊前1个月未内用糖皮质类固醇激素及免疫抑制剂。以化学发光法检测血清IgE水平。 2、正常对照组与辽宁省血液中心合作，收集健康志愿者的血液样本。两组男女比例匹配。沈阳地区正常志愿献血者250例。已排除有过敏性哮喘、过敏性鼻炎及荨麻疹、湿疹、枯草热等异位性表现者。 血液样品处理：抽静脉血3ml，用2％EDTA抗凝。置于-80℃深低温冰箱中保存，以备提基因组DNA。 (二)实验方法：用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析方法(restncuon fragment ieng}n polymorphism RFLP) 1、采用酚-氯仿法提取基因组DNA从NCBI数据库中获取SPINK5基因(GenebankNM_006846)的序列，参照文献设计引物序列。PCR的体系：10xLAbuffer 2ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，dNTP 2ul，LATaq酶0.1ul，DNA模板1ul，双蒸水加至20ul。PCR的条件：94℃3min预变性后，经35个循环，每个循环的组成：94℃30s，52℃-53℃30s，72℃30s，最后延伸72℃5min。经PCR方法扩增包含A1103G(Asn368Ser)、G1156A(Asp386Asn)、G1258A(Glu420Lys)、G2475T(Glu825Asp)多态位点的相应片段。扩增的片段大小分别为：A1103G：367bp；G1156A:367 bp；G1258A：356 bp；G2475T： 325 bp。上述四个基因位点分别用限制性内切酶Bts Ⅰ，Mbo Ⅰ，Hinf Ⅰ，FOK Ⅰ，在37℃水浴10小时进行消化。用2％琼脂糖凝胶电泳分离方法进行分析。 2、统计学处理方法所有资料均用统计软件包SPSS11.5建立数据库。记录全部个体的分型结果。所有统计学分析过程均采用SPSS11.5软件完成。年龄以中位数士四分位间距表示。计算各等位基因与基因型频率。等位基因频率和基因型频率采用直接基因计数法计算，等位基因频率=等位基因阳性数/(总个体数×2)，基因型频率=携带等位基因的人数/总个体数。Hardy-Weinberg平衡用卡方检验，应用自由度为1的卡方检验来判断各多态位点是否符合Hardy-Weinberg平衡。卡方检验还用于单因素分析时检验多态与疾病间的关联。对病例组的部分相关因素行单因素非条件logistic回归分析。P值小于0.05差异具有显著性。 二、SCCE基因多态性与异位性皮炎相关性的研究 (一)研究对象 1、病例组即异位性皮炎组。2005年3月至2007年1月在中国医科大学附属一院皮肤科门诊就诊的沈阳及周边地区患者60例。诊断标准为williams标准。所有病例于就诊前1个月未内用糖皮质类固醇激素及免疫抑制剂。以化学发光法检测血清IgE水平。 2、正常对照组为沈阳地区正常志愿献血者120例。已排除有过敏性哮喘、过敏性鼻炎及荨麻疹、湿疹、枯草热等异位性表现者。与辽宁省血液中心合作，收集健康志愿者的血液样本。两组男女比例匹配。 血液样品处理：抽静脉血3ml，用2％EDTA抗凝。置于-80℃深低温冰箱中保存，以备提基因组DNA。 (二)实验方法： 1、用等位基因特异性PCR方法研究样品提取基因组DNA详见论文一。从NCBI数据库中获取SCCE基因(Genebank NM 005046)的序列，用GENE RUNNER及Dnaman软件设计引物。其中反义链R2的3’末端与突变型的等位基因互补，而反义链R1则于野生型等位基因互补，形成片段长度为363bp。反义链R3与正义链F形成的片段长度为192bp，为内参照片段。PCR扩增：每个样品分别进行2次PCR反应，分别加入反义链R1及R2，将2次PCR反应的结果结合起来分析基因型结果。PCR体系：10×Labuffer1ul，上游引物F 0.5ul，下游引物R1/R2 0.3ul，下游引物R3 0.2，dNTP 2ul，LATaq酶0.1ul，DNA模板1ul，双蒸水加至20ul。PCR．扩增：94℃3min预变性后，经35个循环，每个循环的组成：94℃30s，58℃30s，72℃30s，最后再72℃延伸5分钟。 2、统计方法同论文一。 三、异位性皮炎流行病学调查的研究 (一)研究对象7000例，分别来自市第85中学、第86中学、第90中学、浑南第1小学、沈阳大学机关幼儿园、本溪市实验小学及本溪市第二高中的学生。 (二)研究方法： 1、流行病学调查以问卷方式进行。 2、由调查员到学校校医室对根据问卷内容诊断为AD的调查对象进行抽样专科体检，同时仔细核实问卷内容。用Williams标准确诊异位性皮炎。 3、所有资料均用统计软件包SPSS11.5建立数据库，采用双遍输入，进行核对。 研究结果： 一、SPINK5基因多态性与AD的相关研究。 1、研究对象一般情况AD病例共91人，年龄1岁～67岁，年龄中位数为15岁±19岁。男性1～10岁年龄组的比例高于女性组，而女性组31～67岁年龄组的比例高于男性组。 2、病例组与对照组比较在本研究中，病例组人群中SPINK5基因位点1103G、1156A、1258A、2475T的等位基因频率分别为：0.60、0.44、0.54、0.60，正常对照组人群SPINK5基因位点1103G、1156A、1258A、2475T等位基因频率分别为：0.47、0.45、0.48、0.47。 3、病例组内各相关因素及IgE不同水平组间比较过敏性哮喘、一级亲属有异位症史等因素的分析结果发现：基因位点G2475T中GG及GT基因型频率在AD伴过敏性哮喘病人及AD不伴有过敏性哮喘病人之间有显著统计学差异(P<0.05)。 二、SCCE基因多态性与AD的相关研究。 1、研究对象一般情况AD病例60人，年龄1岁～64岁，年龄中位数为14.5岁±14.5岁。男性31人，女性29人，男女比例1.45∶1。在不同性别间及不同年龄组间分布均衡。病例组中有26例病人血清IgE水平高于正常值，在不同性别间及不同年龄组间分布无显著性差异在AD的相关因素(过敏性鼻炎、过敏性哮喘、经常皮肤瘙痒、经常出汗时瘙痒、全身皮肤干燥、身体屈侧皮炎、2岁前发病、初发于面部)中，病例组人群在不同性别组中分布均衡．家族异位症史阳性人群在不同性别组中分布均衡。 2、病例组与对照组间比较病例组中基因型 AACC/AACC、 AACC/AACCAACC、AACCAACC/AACCAACC的基因型频率分别为0.12、0.08、0.78；等位基因AACC、AACCAACC的频率分别为0.17、0.83。 三、异位性皮炎的流行病学调查。 1、研究对象一般情况本次调查人口总数7000人，回收问卷6794份。在回收的问卷中，有654份因填写不规范而未被录入数据库进行统计学分析，有效调查问卷为6140份。年龄中位数为15±4岁，年龄分布以6-16岁者为多，而大于或小于这一年龄段者相对偏少。 2、AD的患病率2006年7-9月，两地总的患病率为0.98。男性标化患病率为1.19，女性标化患病率为0.82，差异无显著意义，P>0.05。 3、AD的相关因素AD患者伴有皮肤干燥、过敏性鼻炎者、过敏性哮喘、身体屈侧皮炎、经常性的皮肤瘙痒、经常皮肤出汗时瘙痒的伴发率较高。 4、可能与AD有关的影响因素60例．AD患者中共有34例患者其家长吸烟。AD组与非AD组比较，家长吸烟率没有显著性差异(P>0.05)。经单因素及多因素非条件Logisfic回归分析显示家里潮湿、家里有宠物是AD的危险因素，剖腹产是AD的保护性因素。 研究结论： 1、SPINK5基因A1103G(Asn368Ser)、G1258A(Glu420Lys)、G2475T、(Glu825Asp)多态与AD有密切关系。在有、无AD的相关因素(过敏性鼻炎、过敏性哮喘、经常皮肤瘙痒、经常出汗时瘙痒、全身皮肤干燥、身体屈侧皮炎、2岁前发病、初发于面部)人群中，基因型及等位基因频率均无显著性差别。基因位点G2475T的基因型GT是AD伴有过敏性哮喘的危险因素。 2、SCCE基因3’UTR区AACC插入多态性与AD有密切关系。在AD的相关因素(过敏性鼻炎、过敏性哮喘、经常皮肤瘙痒、经常出汗时瘙痒、全身皮肤干燥、身体屈侧皮炎、2岁前发病、初发于面部)中，基因型及等位基因频率均无显著性差别。基因型及等位基因频率在病人血清中的IgE水平高、低组间无显著性差异。 3、AD是影响青少年儿童的常见病。2006年7～9月，两地总的患病率为0.98。男性标化患病率为1.19，女性标化患病率为0.82，差异无显著意义，P>0.05。

目录

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中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

论文一 中国北方人群SPINKS5基因多态性位点与异位性皮炎的相关研究

前言

研究对象和方法

结果

讨论

结论

论文二 异位性皮炎与角层糜蛋白酶（SCCE）基因多态性的相关研究

前言

研究对象和方法

结果

讨论

结论

论文三 异位性皮炎的流行性病学调查研究

前言

研究对象与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

附录

综述 SPINK5基因、SCCE基因与异位性皮炎关系进展

在学期间科研成绩

致谢

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