5-氟尿嘧啶和柳氮磺胺吡啶对胰腺癌细胞BxPC-3体内体外凋亡及增殖的作用

摘要

目的： 本研究目的在于通过抑制NF-к B活性消除胰腺癌细胞对5-FU化疗耐药并探讨5-FU和sulfasalazine对胰腺癌细胞株BxPC-3抗增殖作用是否与诱导胰腺癌细胞凋亡有关。我们应用RT-PCR和Western Blot检测NF-к B(P65)、Bcl-2、MDR、cyclinD1 mRNA和蛋白水平的变化，探讨在体内、外条件下sulfasalazine，5-FU单独及联合作用于胰腺癌细胞株BxPC-3及细胞BxPC-3裸鼠异位移植瘤上述凋亡相关基因表达之间关系及相互作用机制，为深入研究胰腺癌凋亡机制、多药耐药及细胞增殖周期内在联系，为克服胰腺癌多药耐药提供一定的实验依据。 方法： 一、细胞培养细胞株BxPC-3用RPM11640培养液(10％胎牛血清，2.0mmol/L谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100mg/L链霉素)在37℃，5％CO<,2>条件培养。 二、采用四甲基唑蓝(MTT)法检测生长抑制率不同浓度的(12.5，25，50，100 mg/L)5-FU、(25，50，100，200 mg/L)sulfasalazine单独及联合作用(终浓度为100+200，100+100，50+200，50+100 mg/L)细胞BxPC-3在不同时间的生长抑制率，并设立各自同期阴性对照组，酶联免疫检测仪在波长570nm测吸收光度值(A值)，计算生长抑制率=(阴性对照组A<,1>值-用药组A值)/(阴性对照组A<<1>值一空白组A<,n>值)×100％，上述实验重复3次。 三、PI染色法检测细胞BxPC-3中晚期凋亡率及细胞周期的变化不同浓度的(12.5，25，50，100mg/L)5-FU、(25，50，100，200mg/L)sulfasalazine单独及联合作用(终浓度为100+200，100+100，50+200，50+100mg/L)同步化的细胞BxPC-3在不同时间(12，24，36，48h)的中晚期凋亡率及细胞周期变化，设3个阴性对照组(分别为0.09％NaCl，0.2％DMSO，0.09％NaCl+0.2％DMSO)，低于G<,1>期亚二倍体细胞为凋亡细胞，用CELL Quest软件(Becton Dickson，美国)分析样本，测出各细胞周期百分率和凋亡率，并按以下公式计算增殖指数(PI)：PI=(S+G<,2>/M)/(G<,0>/G<,1>+S+G<,2>/M)。每个样本检测10，000个细胞，上述实验重复6次。 四、PI/Annexin-V 双染法检测早期凋亡率(100mg/L)5-FU、(200mg/L)sulfasalazine单独及联合作用同步化的胰腺癌细胞株BxPC-3在不同时间(12，24，36，48h)的早期凋亡率，设3个阴性对照组(分别为0.09％NaCl，0.2％DMSO，0.09％NaCl+0.2％DMSO)，冷PBS洗涤2次，离心1000rpm 5分钟4℃，弃上清，细胞重悬于200ul binding buffer；加10ulAnnexin V-FITC和5ul PI，轻轻混匀，4℃避光反应30分钟，每个样品加300ulBinding buffer，在1小时内上机检测，上述实验重复6次。 五、免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白的表达(100mg/L)5-FU，(200mg/L)sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3 24h时NF-к B(P65)，Bcl-2，cyclinD1蛋白表达，并设立各自阴性对照组，95％乙醇固定30min，1％Triton-X-100作用30min，分别与兔抗人NF-к B(P65)，Bcl-2，cyclin D1抗体4℃结合24h，与生物素标记山羊抗兔IgG 37℃ 10min，DAB显色，苏木素复染，梯度脱水中性树胶封固。根据阳性细胞数和染色强度行半定量分析。 六、相差显微镜观察细胞形态变化观察(100mg/L)5-FU，(200mg/L)sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-324h及各自对照组细胞形态变化。 七、透射电镜观察细胞内超微结构变化(100mg/L)5-FU，(200mg/L)sulfasalazine单独及联合作用细胞BxPC-3及各自对照组细胞24h后，PBS洗涤2次，2.5％戊二醛前固定，1％锇酸后固定，乙醇脱水，树脂包埋，超薄切片，电子染色，透射电镜下观察。 八、扫描电镜观察细胞表面的微细结构变化(100mg/L)5-FU，(200mg/L)sulfasalazine单独及联合处理细胞BxPC-3及各自对照组细胞24h后，PBS洗涤2次，2.5％戊二醛前固定，0.3％硝酸银染色20秒，脱水后液态CO<,2>干燥，喷金包埋。每个样本取8个区域，于10，000x扫描电镜下观察。 九、实验裸鼠皮下异位移植瘤模型建立及实验分组BALB/c nu/nu裸小鼠雄：雌性比3：1，鼠龄4-6周，体重(20±2)g，共66只，在SPF条件下饲养。收集体外大量培养细胞株BxPC-3制成浓度为5.0×10<'6>个/ml单细胞悬液，在无菌条件下接种于裸小鼠肩胛背部为0.5ml/只，经过2-3个月，待移植瘤直径达到0.6-0.8cm，将移植瘤裸鼠随机分为11组，5-FU、sulfasalazine联合作用组(15+20，15+10，7.5+20，7.5+10mg/kg)、sulfasalazine单独作用组(20，10mg/kg)、5-FU单独作用组(15，7.5mg/kg)及各自阴性对照组分别为control1(NS：DMSO=1：1混合液)、controL2(DMSO)、control3(NS)：按上述方案移植瘤体内注射，隔日1次，治疗共4周，颈椎脱位处死裸鼠，取出肿瘤称重，测量大小，放入EP管中存于-70℃冰箱中备用。 十、RT-PCR法检测5-FU、sulfasalazine单独及联合作用胰腺癌细胞BxPC-3及皮下异位移植瘤凋亡相关基因(Bcl-2，cyclinD1，Bax及NF-к B(P65))的mRNA水平变化收集移植瘤各处理组、收集各处理组细胞及各自对照组，RNAout提取总RNA，在紫外线分光光度仪测定总RNA含量，取1ul总RNA为模板按照TakaRa公司RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0操作步骤，逆转录合成cDNA，其反应体系为10ul，PCR仪扩增反转录反应产物，反应体系为40 ul，结果采用紫外凝胶成像分析系统行目的基因表达水平半定量分析，以上实验重复6次。 十一、Western Blot检测检测5-FU、sulfasalazine单独及联合作用胰腺癌细胞BxPC-3及皮下异位移植瘤凋亡相关基因(Bcl-2，oyclinD1，Bax，MDR1及NF-к B(P65))的蛋白水平变化。 取移植瘤各处理组或收集各处理组及各自对照组，冷PBS洗涤3次，置于冷裂解液(50mmol/L Tris[PH 7.4]，150mmol/L NaCl，2.0mmol/L EDTA，1％NP-40)中，4℃离心12，000g 15min，按上述方法制备的20 μg溶胞产物加到样本缓冲液中，煮沸，取等量蛋白行SDS-PAGE电泳，分离蛋白转印，脱脂奶粉封闭，加入一抗(1：200)4℃过夜，TTBS漂洗5min，2次，与二抗(1：200)反应2h，漂洗2次，AP显色30min，成像分析软件Fluorchem V 2.0测定主带吸光度值计算上述指标的蛋白表达水平，以上实验重复6次。 结论： Sulfasalazine有抑制胰腺癌细胞BxPC-3增殖和增强5-FU诱导细胞凋亡作用，二者作用细胞BxPC-3有协同生长抑制作用，此作用与二者协同诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞于Go/G<,1>期密切相关。 Bcl-2，cyclinDl，MDR1及NF-к B(P65)mRNA和蛋白水平下调是sulfasalazine协同增强5-FU诱导细胞BxPC-3凋亡作用机制之一。 Sulfasalazine可协同增强5-FU诱导裸鼠皮下异位移植瘤胰腺癌细胞BxPC-3凋亡作用：Bax水平上调，Bcl-2，cyclinD1，MDR1及NF-к B(P65)水平下调可能是二者联合作用皮下异位移植瘤凋亡机制之一。

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英文论著摘要

英文缩略语

论文一 5-氟尿嘧啶和柳氮磺胺吡啶体外对胰腺癌细胞株BxPC-3抗增殖影响

前言

材料与方法

结果

附论文图表

讨论

结论

论文二 柳氮磺胺吡啶和5-氟尿嘧啶诱导胰腺癌细胞株BxPC-3凋亡基因、多药耐药基因的作用

前言

材料和方法

结果

附论文图表

讨论

结论

论文三 Sulfafalazine和5-FU对胰腺癌细胞株BxPC-3裸鼠皮下异位移植瘤凋亡基因、多药耐药基因的作用

前言

材料和方法

结果

附论文图表

讨论

结论

本研究创新自我评价

参考文献

综述 NF-κB在胰腺癌凋亡调控、多药耐药机制及抗增殖的作用

在学期间科研成绩

致谢

个人简历