UVA对人皮肤角质形成细胞TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响及抗氧化剂、JNK抑制剂的干预研究

摘要

本研究通过体外培养的人永生化角质形成细胞(HaCaT‘细胞株)，探讨UVA照射对人KC细胞TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响，并分别以抗氧化剂(β-胡萝卜素)、JNK抑制剂(SP600125)干预处理，揭示氧化应激和JNK传导通路在UVA诱导人KC细胞TNF-α、IL-1β、IL-10表达中的作用。 实验方法 一、细胞培养 HaCaT细胞以MEM培养基(内含1‰非必需氨基酸、10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素)于37℃、5％CO<,2>及饱和湿度条件下培养，待细胞呈单层、亚融合状态时，以0.25％胰蛋白酶消化，制成单个细胞悬液后传代培养。 二、细胞活力 将细胞接种于96孔培养板中，37℃、5％CO<,2>及饱和湿度条件下培养，待细胞生长至约60％融合，弃培养液，PBS冲洗3次，按100μl/孔加入PBS，以0～3.6 J/cm<'2>不同剂量的UVA照射细胞，MTT法检测各组细胞活力。待细胞培养至约60％融合，向细胞培养液中加入终浓度为3μM的β-胡萝卜素(DMSO溶解)，对照组和照射组加入等量DMSO。1h后弃培养液，PBS冲洗3次，按100μl/孔加入PBS，以0～3.6 J/cm<'2>不同剂量的UVA照射干预组和照射组细胞，再按上述方法检测各组细胞活力。 三、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平将细胞接种于预先置有盖玻片的6孔培养板中，培养2d，弃培养液，PBS冲洗3次，按1.0ml/孔加入PBS，以2.4 J/cm<'2>UVA照射细胞，分别于照射后0、2、4、12、24、48h采样。对照组细胞不照射，其他处理同照射组。免疫荧光法检测细胞磷酸化JNK和非磷酸化JNK水平。 按上述方法培养细胞。向干预组细胞的培养液中加入终浓度为3μM的β-胡萝卜素(DMSO溶解)，对照组和照射组加入等量DMSO。1h后弃培养液，PBS冲洗3次，以1.0ml/孔加入PBS，照射组和干预组细胞以2.4．J/cm<'2>UVA照射，再按上述方法采样并检测各组细胞磷酸化JNK和非磷酸化JNK水平。 四、TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平及蛋白表达将细胞接种于9.0cm平皿中培养，待细胞呈亚融合状态，弃培养液，PBS冲洗3次，按5.0ml/皿加入PBS，根据细胞活力检测结果，选择2.4 J/cm<'2>作为UVA辐射剂量，分别于照射后0、2、4、12、24、48h收集细胞及上清液。对照组不照射，其他处理同照射组。RT-PCR方法检测细胞TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平；ELISA方法检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10含量。 待细胞呈亚融合状态，向干预组细胞的培养液中加入终浓度为3μM的β-胡萝卜素或10μM的SP600125(DMSO溶解)，对照组和照射组加入等量DMSO。1h后弃培养液，PBS冲洗3次，按5ml/皿加入PBS，照射组和干预组细胞经2.4/cm<'2>UVA照射，再按上述方法采样并检测各组细胞TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA及蛋白水平。 五、统计分析 采用SPSS 12.0统计软件对实验数据进行分析，检验水准α为0.05。 实验结果 一、细胞活力 3.0、3.6 J/cm<'2>UVA照射使细胞活力明显降低(P<0.05)；2.4 J/cm<'2>及其以下剂量的UVA照射对细胞活力无明显影响；β-胡萝卜素预处理细胞后，各组细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)。 二、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平2.4 J/cm<'2>UVA照射HaCaT细胞后0～24h，磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平均逐渐升高，24h达高峰，48h有所降低，但仍高于0～12h各检测时点；对照组磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平则随着采样时点延长而逐渐升高，48h达高峰。统计结果表明，照射组细胞磷酸化JNK水平在各采样时点及非磷酸化JNK水平于0～2h及12～48h均明显高于对照组(P<0.05)。 β-胡萝卜素干预组细胞磷酸化JNK水平于照射后Oh基本同照射组，二者均明显高于对照组(P<0.05)；2h后干预组细胞磷酸化JNK水平明显低于照射组(P<0.05)，24h后明显低于对照组(P<0.05)；β-胡萝卜素干预组细胞非磷酸化JNK水平于0～48h均明显低于照射组(P<0.05)，4～48h明显低于对照组(P<0.05)。 三、TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平及蛋白表达 (一)TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平0～48h对照组细胞TNF-α、IL-1β mRNA水平较平稳；照射组细胞TNF-α、IL-1β mRNA水平于照射后0h开始升高，2h达高峰，12h后恢复至对照组水平。统计结果表明，O～4h照射组细胞TNF-α、IL-1β mRNA水平明显高于对照组(P<0.05)。 β-胡萝卜素干预组细胞TNF-α、IL-1β mRNA水平于照射后0～48h基本同对照组，0～4h干预组及对照组细胞TNF-α、IL-1β mRNA水平均明显低于照射组(P<0.05)，12～48h各组细胞TNF-α、IL-1β mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。SP600125干预组细胞TNF-αmRNA水平于照射后0～48h均低于照射组，其中，0～4h及24～48h两组差异有统计学意义(P<0.05)，并于12～48h干预组细胞TNF-αmRNA水平明显低于对照组(P<0.05)；SP600125干预组细胞IL-1β mRNA水平于照射后0～48h均明显低于照射组(P<0.05)，并于12～48h明显低于对照组(P<0.05)。以2.4 J/cm<'2>UVA照射细胞后12h，IL-10 mRNA呈弱表达，照射组其他各检测时点及对照组、β-胡萝卜素和SP600125干预组细胞均未见IL-10 mRNA表达。 (二)TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表达0～48h对照组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平较平稳；照射组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于照射后0～4h基本同对照组，12h高于对照组，24h后恢复至对照组水平。统计结果表明，照射组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于照射后12h明显高于对照组(P<0.05)。 β-胡萝卜素干预组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于照射后0～48h基本同对照组，干预组及对照组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于12h明显低于照射组(P<0.05)。SP600125干预组细胞TNF-α蛋白表达水平于0～48h均低于照射组和对照组，其中，12～48h明显低于照射组(P<0.05)，24～48h明显低于对照组(P<0.05)。SP600125干预组细胞IL-1β蛋白表达水平于0～4h基本同对照组和照射组，12h明显高于对照组(P<0.05)，但明显低于照射组(P<0.05)，24～48h明显高于照射组和对照组(P<0.05)。 以2.4 J/cm<'2>UVA照射细胞后24h，培养液中可检测到较低水平的IL-10蛋白，照射组其他各检测时点及对照组、β-胡萝卜素和SP600125干预组细胞均未检测到IL-10蛋白表达。 结论 3.0 J/cm<'2>及其以上剂量的UVA照射使体外培养的HaCaT细胞活力明显降低，β-胡萝卜素对UVA诱导的HaCaT细胞活力下降具有拮抗作用。 2.4．J/cm<'2>UVA照射使HaCaT细胞JNK活性增强，β-胡萝卜素对UVA致HaCaT细胞JNK活性增强具有拮抗作用。 2.4．J/cm<'2>UVA照射使HaCaT细胞TNF-α及IL-1β基因转录增强、蛋白表达增多，正常情况下HaCaT不表达IL-10，UVA照射可诱导其表达。β-胡萝卜素、SP600125对UVA上调HaCaT细胞TNF-α、IL-1β表达以及对IL-10表达的诱导均具有拮抗作用。

目录

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中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

论文一UVA对人皮肤角质形成细胞TNF-a、IL-1β、IL-10表达的影响

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三JNK在UVA诱导人皮肤角质形成细胞TNF-α、IL-1β、IL-10表达中的作用

前言

实验材料与方法

实验结果

一、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平（1）

一、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平（2）

讨论

结论

本研究创新性自我评价

参考文献

综述过量紫外线照射致机体免疫抑制机理的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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