骨髓干细胞移植对马兜铃酸肾病大鼠模型肾小管上皮细胞分化潜能及治疗作用探讨

摘要

目的：马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy，AAN)是由于服用含有马兜铃酸(chronic aristolochic acid，AA)的中草药导致的肾损害疾病，病理改变主要为肾小管萎缩消失、肾小管基底膜增厚屈曲；肾间质片状或弥漫性纤维化；小动脉壁增厚、管腔狭窄；肾小球缺血性皱缩、硬化。多数为慢性AAN(chroilic adstolochicacid nephropathy，CAAN)，呈现典型的慢性肾小管间质肾病，而慢性肾脏疾病的进展是一个不可逆转的过程，最终导致终末期肾衰竭。 目前CAAN的发病机制尚未十分清楚，所以缺乏统一可靠的治疗方法，深入探讨AAN的发生机制，寻找新的有效预防和治疗措施，控制和延缓肾衰竭进展，是目前研究的重点之一。 近年来干细胞移植已成为医学领域的研究热点。研究证明，骨髓干细胞除向血液系统定系分化外，还可以跨系分化为其他系统有功能的组织成分，包括向肾组织细胞分化，这为难治性肾脏疾病(如CAAN)的治疗提供了新思路。本研究通过建立CAAN动物模型，并予以骨髓干细胞移植，旨在探讨干细胞向CAAN肾脏细胞分化的潜能及对CAAN的治疗作用，并进而推断CAAN的发病机制。 本试验从以下三个方面进行了研究：①骨髓源性干细胞向慢性马兜铃酸肾病大鼠肾小管上皮细胞分化潜能的研究；②干细胞移植对慢性马兜铃酸肾病大鼠的治疗作用；③干细胞移植对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾组织α-SMA、CK18、TGF-β1、HGF表达的影响。 材料与方法： 第一部分：雌性Wistar大鼠37只，随机分为2组：①移植组(n=16只)，予以关木通煎剂灌胃(20g．kg<'-1>.d<'-1>，相当于10ml．kg<'-1>．d<'-1>)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以亚致死剂量X线照射后经尾静脉注射途径移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干细胞(骨髓干细胞1×10<'8>个/只，0.35ml/只)。于尾静脉注射干细胞后第30天、第60天分别处死8只大鼠。②非移植组(n=21只)，予以关木通煎剂灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相当于10m1．kg<'-1>．d<'-1>)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以尾静脉注射等量生理盐水(0.35ml/只)，于尾静脉注射生理盐水后第30天、第60天分别处死8只大鼠。其中随机选取5只大鼠于注射生理盐水前与移植组一起接受x线照射，并于第30天时处死5只大鼠。另设正常对照组(n=5只)：均为雄性Wistar大鼠，自由进食水，实验结束时全部处死。大鼠在处死时留取肾组织标本。本部分用连续切片做免疫荧光(IF)染色结合Y染色体荧光原位杂交(Y-FISH)方法，主要观察移植组大鼠肾组织中骨髓源性干细胞的分化情况。非移植组(第30天时)，肾组织切片做HE染色观察X线照射对肾组织病理改变的影响。 第二部分：雌性Wistar大鼠40只，随机分为3组：①移植组(n=16只)，予以关木通煎剂灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相当于10m1．kg<'-1>．d<'-1>)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以亚致死剂量X线照射后经尾静脉注射途径移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干细胞(骨髓干细胞1×10<'8>个/只，0.35ml/只)。于尾静脉注射干细胞后第30天、第60天分别处死8只大鼠。②非移植组(n=16只)，予以关木通煎剂灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相当于10m1．kg<'-1>．d<'-1>)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以尾静脉注射等量生理盐水(0.35ml/只)。于尾静脉注射生理盐水后第30天、第60天分别处死8只大鼠。③正常对照组(n=8只)，予以饮用水10ml．kg<'-1>．d<'-1>(分两次给予)灌胃，每周连续5天，共12周，然后经尾静脉注射等量生理盐水(0.35ml/只)。并于尾静脉注射生理盐水后第60天处死8只大鼠。大鼠在处死前留尿测24小时尿蛋白定量、处死时留取血、尿标本。做血尿素氮、肌酐、血红蛋白、尿β<,2>-MG、尿NAG检测。观察各组大鼠临床相关指标的动态变化。 第三部分：雌性Wistar大鼠40只，随机分为3组：①移植组(n=16只)，予以关木通煎剂灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相当于10ml．kg<'-1>．d<'-1>)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以亚致死剂量X线照射后经尾静脉注射途径移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干细胞(骨髓干细胞1×10<'8>个/只，0.35ml/只)。于尾静脉注射干细胞后第30天、第60天分别处死8只大鼠。②非移植组(n=16只)，予以关木通煎剂灌胃(20g．kg<'-1>．d<'-1>，相当于10ml．kg<'-1>．d<'-1>)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以尾静脉注射等量生理盐水(0.35ml/只)。于尾静脉注射生理盐水后第30天、第60天分别处死8只大鼠。③正常对照组(n=8只)，予以饮用水10ml．kg<'-1>．d<'-1>(分两次给予)灌胃，每周连续5天，共12周，然后经尾静脉注射等量生理盐水(0.35ml/只)。并于尾静脉注射生理盐水后第60天处死8只大鼠。大鼠在处死时留取肾组织标本。做HE及Masson染色，光镜观察干细胞移植前后CAAN大鼠肾脏组织形态学变化情况；电镜观察肾小管上皮细胞的超微结构变化；应用免疫组化方法检测移植前后肾脏αc-SMA、CK18、 TGF-β<,1>和HGF表达的变化；RT-PCR方法检测移植前后α-SMA、CK18、TGF-β<,1>和HGF的mRNA表达变化；Western blot技术检测移植前后α-SMA、CK18、FGF-β<,1>和HGF的蛋白表达变化。数据处理：采用SPSS12.0统计软件分析处理，计量数据x±s表示，组间差异采用单因素方差分析，P<0.05为有显著性差异。 结果： 第一部分：①正常对照组：雄性大鼠肾组织切片经Y-FISH检测观察到Y染色体阳性(Y<'+>，黄绿色荧光亮点)杂交细胞。②非移植组：雌性CAAN大鼠，生理盐水注射后第30天及第60天肾组织切片经Y-FISH检测均未观察到Y<'+>杂交细胞。③移植组：在骨髓干细胞移植后第30天、第60天时，大鼠肾组织切片经Y-FISH检测亦观察到Y<'+>杂交细胞，同时连续切片做免疫荧光染色检测观察到其表达肾小管上皮细胞的表型特征CKl8和RCA Ⅰ(CK18<'+>、RCA Ⅰ<'+>)。④非移植组(第30天时)经X线照射和未照射大鼠肾组织切片做HE染色：结果未发现两组大鼠形态结构存在明显差异，说明该剂量X线照射对CAAN肾脏无特殊影响。 第二部分：肾功能测定结果：非移植组BUN、Cr逐渐升高，第30天、第60天时BUN值分别为19.25±4.26、25.04±6.5，与正常对照组比较有统计学意义P<0.01；移植组BUN、Cr明显降低，第30天、第60天时BUN值分别为11.47±3.19、9.71±3.74，与非移植组比较有统计学意义P<0.01但仍高于正常对照组高，差异有统计学意义P<0.01。 第三部分：肾脏病理学检查发现非移植组损伤严重、肾间质纤维化明显，肾间质纤维化面积于第30天、第60天分别为0.20±0.016、0.25±0.02，经干细胞移植后损伤减轻、无明显纤维化，纤维化面积分别为0.13±0.006、0.12±0.005，与正常对照组和移植组相比，非移植组大鼠肾间质纤维化面积明显增加P<0.01；电镜观察移植组肾小管上皮细胞超微结构较对照组明显改善。 结论： 本研究结果表明： (1)移植组(第30天、第60天)和正常对照组(雄性)大鼠肾组织切片经Y-FISH检测均观察到Y染色体阳性杂交细胞，而非移植组雌性CAAN大鼠肾组织切片经Y-FISH检测未观察到Y<'+>细胞；同时，移植组大鼠肾组织切片经免疫荧光检测观察到这些Y<'+>细胞部分表达肾小管上皮细胞的表型特征CK18和RCA Ⅰ(CK8<'+>、RCA Ⅰ<'+>)。证明骨髓源性干细胞具有向CAAN大鼠肾脏小管上皮细胞分化的潜能。 (2)骨髓干细胞移植可以明显改善CAAN大鼠的肾功能、提高血红蛋白水平、减少24小时尿蛋白和β<,2>-MG的丢失、降低尿NAG含量。说明骨髓干细胞移植对CAAN有治疗作用。这不仅给CAAN的治疗开拓干细胞治疗的新途径，而且也为其他原因所致的肾衰竭的治疗带来新的希望。 (3)骨髓干细胞移植能明显减轻CAAN大鼠肾脏病理损害，减轻肾间质纤维化；降低肾脏α-SMA、TGF-β1蛋白和mRNA表达，提高肾脏CK18、HGF蛋白和mRNA的表达；从而在细胞和细胞因子水平，证明骨髓干细胞移植能减轻肾损害和肾间质纤维化。这将为CAAN甚至其他肾小管间质纤维化疾病的治疗提供有益的参考。 (4)干细胞移植对CAAN具有治疗作用的实验结果，使我们推测CAAN很可能存在干细胞损伤或缺乏，这也为CAAN发病机制的研究提供新的研究方向和实验室根据。

目录

中国医科大学研究生学位论文独创性声明及版权使用授权书

中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

前言

论文一骨髓源性干细胞向慢性马兜铃酸肾病大鼠肾小管上皮细胞分化的研究

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 干细胞移植对慢性马兜铃酸肾病大鼠的治疗作用

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 干细胞移植对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾组织α-SMA、CK18、TGF-β1、HGF表达的影响

前言

实验材料与方法

结果（一）

结果（二）

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 干细胞及其向肾脏分化的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介