泽泻醇B诱导胃癌细胞凋亡、抑制其侵袭、转移的机制研究

摘要

胃癌是我国常见的恶性肿瘤，占消化道恶性肿瘤第一位，是目前对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，已成为绝大多数国家因癌症死亡的首要原因。目前对胃癌的治疗还是传统的手术、化疗和放疗。尽管传统治疗方法取得了显著进展，但胃癌的病死率仍然居高不下，同时化疗和放疗也往往给患者带来较大的毒副作用。近年来，国内外学者对中医药防治胃癌开展了大量的研究工作，其在防治胃癌发病及提高患者生存率方面的独特疗效，受到国内外学者的广泛关注。诱导细胞凋亡已成为中医药防治胃癌的重要机理之一。
　　 泽泻醇B-23-乙酸酯是三萜类纯中药提取物，为泽泻科植物泽泻[Alismaorientalis(Sam)Juzep]的主要成分，具有利尿、降血脂、抗脂肪肝及保肝、抗炎、抗过敏等作用。近年的研究表明其可通过激活caspase-3诱导肝癌细胞凋亡；使肿瘤细胞阻滞在G2/M期诱导淋巴瘤细胞凋亡；逆转P-gp导致HepG2-DR和K562-DR细胞的耐药性，诱导HepG2-DR和K562-DR细胞凋亡。进一步研究显示其可通过线粒体内源性途径诱导耐激素性前列腺癌PC-3细胞的凋亡，同时前列腺癌细胞促凋亡因子bax蛋白表达增加，并发生细胞质向细胞核的转移。对肺癌的研究提示泽泻醇B具有较强的抗恶性肿瘤转移作用。本实验研究了泽泻醇B对SGC7901细胞增殖、细胞周期及调亡的影响，检测细胞凋亡过程中线粒体膜电位及caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2及PI3 K/Akt信号转导通路的变化；研究泽泻醇B对胃癌细胞侵袭及迁移的影响，及在抑制胃癌细胞侵袭、迁移过程中，MMP-2、MMP-9活性、蛋白及PI3 K/Akt信号转导通路的变化，阐明泽泻醇B诱导胃癌细胞凋亡，抑制其侵袭及转移的机制，为其进一步临床应用提供理论依据。
　　 方法：
　　 一、实验材料
　　 1、人胃腺癌细胞系SGC7901
　　 2、泽泻纯B
　　 3、流式细胞仪检测相关染料
　　 4、Western印迹杂交相关试剂
　　 5、细胞侵袭实验相关材料
　　 二、实验方法
　　 1、MTT检测泽泻纯B对胃癌SGC7901细胞体外增殖的抑制作用
　　 2、PI染色流式细胞仪(FCM)分析细胞周期
　　 3、Annexin V-FITC染色检测细胞早期调亡
　　 4、倒置显微镜、透射电镜观察细胞形态学变化
　　 5、琼脂糖凝胶电泳检测DNA片断化
　　 6、罗丹明-123染色、流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化
　　 7、Transwell小室分析泽泻纯B对胃癌SGC7901侵袭、迁移的影响
　　 8、酶谱分析法检测MMP-2、MMP-9活性的变化
　　 9、Western-blot半定量法检测Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2、PI3 K/Akt、MMP-2、MMP-9表达情况
　　 结果：
　　 1、MTT法检测结果显示30μmol/L以上浓度泽泻纯B对胃癌SGC7901细胞体外增殖的具有明显的抑制作用，该抑制作用呈明显的时间和剂量依赖性(P<0.05或P<0.01)。
　　 2、显微镜下细胞稀疏、变圆、皱缩，一些细胞膜向外鼓出小泡，然后脱落形成凋亡小体；透射电镜，细胞核内异染色质凝聚；细胞核膜溶解，核内异染色质凝聚破碎成多块于胞质中，并见有膜包裹，形成凋亡小体。
　　 3、琼脂糖凝胶电泳见明显的梯形条带，具有时间依赖性(DNA laddrer)。
　　 4、AnnexinV-FITC/PI荧光染色，流式细胞分析AnnexinV/FITC(+)，PI(-)细胞即早期凋亡细胞增加(P<0.05)。
　　 5、PI染色染色流式细胞仪检测细胞周期，S期细胞的比例逐渐降低，G1期细胞的比例逐渐升高，并存在时间依赖性。同时在流式细胞仪DNA组方图上出现典型的凋亡细胞峰(亚G1峰)。
　　 6、罗丹明-123染色流式细胞仪检测线粒体膜电位，泽泻纯处理12小时后SGC7901线粒体膜电位开始下降，随着作用时间的延长下降比例逐渐增加具有时间依赖性。
　　 7、Western-blot半定量法检测Bax表达增高，持续维持在高水平；Bcl-2表达降低，持续维持在低水平
　　 8、Western-blot半定量法检测caspase-3和caspase-9，caspase-3出现17ku的断裂片段，47 kucaspase-9出现37 ku的断裂片断，且二者的活性片断随着泽泻纯作用时间的延长持续维持在高水平；
　　 9、Western-blot半定量法检测磷酸化的PI3 K、Akt(Thr308)表达量降低，而总的PI3 K、Akt的量没有变化。
　　 10、细胞侵袭迁移能力的检测。
　　 应用Transwell小室检测泽泻纯B对胃癌SGC7901细胞侵袭、迁移能力的影响，发现泽泻纯B处理后实验组细胞的侵袭、迁移能力有明显降低，迁移及侵袭过Transwell小室膜的细胞随药物浓度的增加逐渐减少，并具有剂量依赖性
　　 11、酶谱分析法检测泽泻纯B处理前后SGC7901细胞MMP-2、MMP-9酶活性，Western-blot半定量法检测MMP-2，MMP-9蛋白表达量情况，随着药物作用时间的延长MMP-2、MMP-9酶活性逐渐降低，MMP-2，MMP-9蛋白表达量逐渐下降，并具有时间依赖性
　　 结论：
　　 1、泽泻纯B对胃癌SGC7901细胞体外增殖具有明显的抑制作用，该抑制作用呈明显的时间和剂量依赖性
　　 2、显微镜下、透射电镜DNA片断化分析及AnnexinV-FITC/PI荧光染色流式细胞分析证实了泽泻纯B诱导SGC7901细胞的凋亡。
　　 3、泽泻纯B诱导SGC7901细胞凋亡的信号转导途径中多种基因、蛋白酶以及多种激酶参与了凋亡的调控。Bcl-2、Bax表达的改变，线粒体膜电位的下降，进而caspase-9、caspase-3的激活，PI3 K/Akt激酶的激活参与细胞凋亡的调控。
　　 4、泽泻纯B导致SGC7901细胞周期的改变，使SGC7901细胞阻抑在G0/G1期，细胞周期的改变参与了细胞凋亡的发生
　　 5、泽泻纯B抑制SGC7901细胞侵袭和转移，MMP-2、MMP-9活性的下降，蛋白表达的降低在泽泻纯B抑制SGC7901细胞侵袭和转移在过程中起重要的调节作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

第一部分 泽泻纯B对胃癌SGC7901细胞凋亡的影响

前言

实验结果

讨论

结论

第二部分 泽泻纯B诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡的机制

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

四、结论

第三部分 泽泻醇B对胃癌SGC7901细胞侵袭力、迁移的影响

前言

实验材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 Caspase与胃癌凋亡关系研究进展

本研究创新性的自我评价

在学期间科研成绩

致谢

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