血小板活化因子致肠黏膜机械屏障损伤的机制及肠三叶因子的保护作用

摘要

近期的体外实验也发现ITF可以调控紧密连接蛋白Claudin-1和Claudin-2的表达而影响肠上皮的跨上皮阻力。但PAF是否可以影响内源性ITF的表达?外源性给予基因重组ITF是否可以起到保护作用?其机制如何?这些问题的回答也为临床应用ITF治疗胃肠黏膜损伤性疾病提供了可靠的理论依据。 材料和方法： 一、细胞培养 Caco-2细胞株，来源于人大肠癌细胞，可分化成有极性的肠上皮细胞。应用含有150ml/L胎牛血清和青霉素-链霉素双抗液的RPMI 1640高糖培养液，在37℃、50ml/L CO2条件下进行培养，每7d按1：2的比例传代。将细胞接种于transwell、盖玻片、六孔板上或培养瓶中，待细胞生长融合至80％左右，换无血清培养液，按实验分组加药，进行后续实验。每种实验均选取至少三组非同代细胞进行。 二、实验分组 分别设正常对照组、实验组(含模型对照组)、ITF预防组、ITF治疗组。正常对照组：不加刺激物及干预因素。 实验组：加入PAF，终浓度分别为50ng/L、100ng/L和200ng/L，并把终浓度100ng/L的组作为模型对照组，分别作用2，4，8，12，24，48h。ITF预防组：先加入ITF0.3g/L，30min后加入PAF100ng/L，共培养24h。ITF治疗组：先加入PAF100ng/L，30min后加入ITF0.3g/L，共培养24h。 三、实验方法及检测指标 1、体外肠上皮细胞屏障模型的建立 应用Caco-2细胞株在transwell上建立体外肠上皮细胞屏障模型，并应用跨上皮细胞电阻(TEER)和荧光黄透过率两种指标检测肠上皮细胞屏障的形成情况。 2、PAF对细胞增殖和凋亡的影响 (1)MTT比色法检测细胞活力，反映细胞增殖情况。 (2)用Annexin V-EGFP和Hoechst试剂盒，应用流式细胞技术和免疫荧光染色技术，通过细胞膜和细胞核染色联合检测细胞凋亡的发生。 3、PAF对肠上皮细胞屏障通透性的影响和ITF的保护作用 (1)TEER的测定：应用EVOM测定Caco-2单层上皮细胞的TEER。 (2)荧光黄透过量的检测：应用荧光黄作为标记物，检测PAF或ITF对Caco-2细胞细胞旁转运的影响。用荧光分光光度计测定荧光黄吸光度(激发波长427nm，发射波长536nm)，根据标准曲线计算荧光黄浓度。 4、PAF和ITF对肠上皮细胞间紧密连接的影响 透射电镜下观察加入PAF或/和ITF不同时间后，Caco-2细胞间紧密连接形态学的改变。 5、PAF和ITF对肠上皮细胞骨架蛋白F-actin的影响 应用罗丹明-鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)特异性荧光探针直接标记F-actin，流式细胞技术测定F-actin的含量；直接免疫荧光技术观察F-actin的定位和重排情况。 6、PAF对内源性ITF表达的影响 给予不同浓度PAF作用不同时间后，应用实时定量PCR技术和免疫组化技术检测PAF对ITFmRNA和蛋白定位的影响。 7、PAF和ITF对肠上皮细胞紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1，ZO-1表达和定位的影响 应用免疫荧光、蛋白印迹杂交(Western blot)和实时定量PCR技术检测肠上皮细胞紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1，ZO-1定位和蛋白、基因表达的变化情况。 结论： 1、培养2-3w的Caco-2细胞可作为体外研究肠上皮细胞屏障的工具。 2、PAF可直接破坏肠上皮细胞屏障，其增加肠上皮细胞通透性的作用是凋亡非依赖性的，其作用位点在旁细胞途径。 3、ITF可以通过恢复紧密连接的结构降低肠通透性，从而发挥其保护作用。 4、PAF引起细胞骨架F-actin的重排和再分布以及蛋白含量的减少，是PAF引起肠上皮细胞屏障通透性增加的机制之一。 5、PAF使内源性ITF基因和蛋白表达减少，抑制了肠道的自我保护和修复能力。 6、外源性重组ITF部分逆转细胞骨架F-actin的重排和再分布，可以作为一个肠道保护因素。 7、PAF可以引起紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的基因和蛋白水平的改变以及异常分布，具有剂量和时间依赖性，且三者的改变具有协同性，这可能是PAF引起肠上皮细胞屏障破坏的内在机制。 8、ITF可以部分恢复紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的基因和蛋白水平改变以及异常分布，恢复紧密连接的正常结构，可能是其保护肠黏膜屏障的一个重要机制。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

论文一：体外肠上皮细胞屏障的建立及PAF对肠上皮细胞屏障通透性的影响和ITF的保护作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二：PAF对细胞骨架F-actin的影响及ITF的保护作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三:PAF对紧密连接蛋白Occludin,Claudin-1,ZO-1表达的影响及ITF的保护作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：肠粘膜机械屏障破坏与胃肠功能障碍

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