骨髓间充质干细胞移植对扩张型心肌病心衰大鼠心功能改善作用机制的研究

摘要

前言
　　由冠心病、心肌病等各种疾病所致的心肌损伤，其最终结果都将导致有功能的心肌细胞大量丧失。成年人类的心肌细胞不能通过自身细胞再生修复，只能形成纤维化瘢痕，逐步发生心室重塑，最终导致心力衰竭。随着分子生物学的发展和对干细胞的深入研究，应用骨髓间充质干细胞(BMMSCs)进行心肌细胞成形术治疗心力衰竭成为目前各国学者研究的热点。
　　大量动物实验和临床观察已证实，骨髓间充质干细胞移植能够促进心肌梗死所致心力衰竭的心功能恢复，但是对于非缺血性心肌病导致的心力衰竭，移植后的效果尚缺乏足够的动物实验及临床实验依据，并且对其机制研究尚少。
　　本实验通过体外培养及诱导大鼠骨髓间充质干细胞，与体外培养的心肌细胞进行超微结构、组织化学与分子生物学比较，研究其诱导后特性。应用阿霉素注射法建立心肌病心衰大鼠模型，成功后心肌内移植标记后的骨髓间充质干细胞，观察其对心功能的影响，并探讨其作用机制。
　　实验方法
　　1、探讨体外培养的骨髓间充质干细胞诱导后的生物学特性取雄性Wistar大鼠体外分离培养骨髓间充质干细胞，传至一代后经10μmol/L的5-氮胞苷体外诱导，免疫组化法观察细胞蛋白表达的变化，电镜下观察细胞诱导前后超微结构的改变，RT-PCR检测心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC的表达，并与体外培养的原代心肌细胞比较，观察二者之间的生物学异同。
　　2、观察同种异体大鼠骨髓间充质干细胞移植在阿霉素诱导的扩张型心肌病心衰大鼠心脏内存活和分化的情况及对心功能的影响雌性Wistar大鼠55只，取正常组(n=10)，应用阿霉素注射法建立扩张型心肌病心衰大鼠模型(n=45)，随机分成心衰对照组(n=15)，心衰+细胞移植治疗A组(n=15)和心衰+细胞移植治疗B组(n=15).将体外分离培养并诱导后的雄性大鼠骨髓间充质干细胞，用DAPI标记，A组移植诱导前的骨髓间充质干细胞，B组移植诱导后的骨髓间充质干细胞;4周后应用血流动力学方法检测各组大鼠心功能情况，荧光法观察移植细胞存活情况，免疫组化法观察细胞分化情况。
　　3、探讨骨髓间充质干细胞心肌内移植对扩张型心肌病心衰大鼠心功能的保护机制应用阿霉素注射法建立扩张型心肌病心衰大鼠模型，成功后心肌内移植DAPI标记的骨髓间充质干细胞，分别于术后1w、2w、3w、4w进行血流动力学检测，观察移植后对大鼠心功能的影响，并于上述时间点取材，利用荧光法观察移植细胞的存活情况，利用免疫组化分析心肌胶原纤维的沉积的改变、RT-PCR法观察血管内皮生长因子(VEGF)及其受体flk-1、flt-1表达的改变。
　　实验结果
　　1、成功进行了骨髓间充质干细胞和心肌细胞的体外分离培养和诱导鉴定，免疫组化法证实诱导后部分骨髓间充质干细胞α-横纹肌肌动蛋白和心肌特异性蛋白肌钙蛋白T染色表达阳性，证实已向心肌样细胞分化;电镜下胞浆内可见糖原颗粒，肌原纤维排列与原代培养的心肌细胞相似;RT-PCR证实诱导后的骨髓间充质干细胞表达心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC。
　　2、同种异体骨髓间充质干细胞移植4周后移植仍可存活并部分分化成心肌细胞，表达心肌细胞特异性蛋白肌钙蛋白T;与心衰对照组比较，细胞移植组心功能明显改善，左室收缩压(LVSP)较心衰对照组升高（122.5±10.2;121.6±11.3vs113.6±12.6）;左室舒张压(LVDP)降低(17.1±6.1;18.4±5.5vs25.4±8.2);左室最大上升下降速率(±dp/dt)升高（3129.6±214.9;3044.2±295.4vs2378.9±351.1）;(2344.9±114.5;2440.1±96.7vs1994.8±160.1)，p均＜0.05，且A组B组间无差异。
　　3、移植细胞在各个时间点均存活，并有部分细胞于术后4W表达心肌特异性蛋白肌钙蛋白T;于术后2W开始，移植组心功能较对照组改善，左室收缩压(LVSP)，左室内压力最大上升及下降速率（±dp/dt）较对照组显著升高，而左室舒张压(LVDP)则显著下降（P均＜0.05）。4w后心肌胶原纤维沉积减少（6.23±0.68vs2.38±0.49，P＜0.01）;VEGF、flt-1、flk-1表达较同期对照组增加，分别于术后2w、3w达到高峰，以后逐渐减弱。
　　讨论
　　1、细胞成形术是治疗心力衰竭的合理途径。BMMSCs由于自体来源，具备多向分化能力，可能是目前最有希望的供体细胞来源。研究证实，BMMSCs移植可改善心脏功能，其机制可能为移植的细胞分化为心肌细胞，参与宿主心脏收缩，改善心室功能。BMMSCs向心肌细胞分化的机制尚不明确，在体外主要是化学诱导。本实验用10μmol/L的5-氮胞苷体外诱导BMMSCs向心肌样细胞分化。结果显示诱导后部分细胞α-横纹肌肌动蛋白与肌钙蛋白T染色阳性，提示BMMSCs经5-氮胞苷诱导后有了明确的心肌细胞化过程。电镜结果显示诱导后的BMMSCs，细胞内细胞器发达，可见糖原颗粒，有明显的肌原纤维排列，与心肌细胞电镜下的结构相似。RT-PCR结果显示诱导后的BMMSCs表达肌原纤维的主要结构组成成份—α-MHC、β-MHC，表达心肌特异性因子ANP、BNP，证实分化后的细胞已经具备了心肌细胞的物质基础和内分泌功能。
　　2、BMMSCs移植可以在心肌内存活并改善心肌梗塞后受损的心脏功能，但对因非缺血性心肌病导致的心力衰竭，细胞移植的效果尚缺乏足够的依据。本研究将诱导前后的BMMSCs同种异体移植到心肌病心衰大鼠模型体内，结果显示移植组的心功能恢复明显优于对照组，并且细胞诱导前后对心功能改善都有明显的作用，二者之间无差异。BMMSCs改善心功能的作用机制可能涉及多个方面，其中移植细胞在宿主心肌内存活并向心肌细胞分化是改善心功能的前提。本研究结果显示，未诱导的BMMSCs移植进入心肌4周后仍能存活，并有部分细胞分化成心肌细胞，表达心肌特异性蛋白-肌钙蛋白T。BMMSCs向心肌细胞分化的机制在体内主要是心肌微环境诱导。BMMSCs移植入心脏后，局部的心脏环境，各种因素包括心腔内压力，心脏舒缩的牵拉作用以及电信号传导刺激等，促发细胞间的连接并改变细胞外的基质构成，从而诱导其分化，即“组织环境学说”。本研究观察到体内外两种方式均可使BMMSCs向心肌细胞分化，这可能即为移植诱导前后的BMMSCs对心功能改善无差异的原因。
　　3、本研究表明，细胞移植组大鼠的心功能有明显的改善，此种改善作用在移植后3w开始体现，这可能与BMMSCs在宿主体内向心肌样细胞分化，促进宿主细胞分泌促进血管生成的细胞因子及改善宿主心脏局部结构，提高局部心肌弹力所需的时间有关。本研究显示移植组胶原纤维融合较少，排列有序，而对照组胶原纤维融合明显，排列紊乱，心肌组织的基本结构受到较大的破坏。这表明BMMSCs移植可在一定程度上防止胶原纤维的融合，保护心肌组织基本结构的有序排列。此外细胞移植改善心功能的机制可能还涉及血管生成增加。本研究证实，BMMSCs移植不但能够上调肌体血管内皮生长因子VEGF的表达，还能够上调VEGF受体Flt-1、Flk-1的表达，这种表达可能对持续促进缺血心肌的血管生成起到重要作用。VEGF与其受体的表达在时间上呈现不同步上调，可以持续稳定的促进血管新生，促进缺血心肌的功能恢复;而在后期，移植细胞引起的血管发生和心肌细胞再生有助于进一步改善心脏功能。
　　结论
　　1、骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷定向诱导后在超微结构和细胞因子的表达上类似于心肌细胞，已向心肌样细胞分化。其电生理特性有待于进一步研究。
　　2、阿霉素注射法可成功建立扩张型心肌病心力衰竭大鼠模型，同种异体骨髓间充质干细胞移植4周后可存活并部分分化成心肌细胞，对扩张型心肌病心衰大鼠的心功能有保护作用，细胞诱导前后对心功能改善的结果无差异。
　　3、骨髓间充质干细胞移植通过上调受体内VEGF和flt-1、llk-1的表达，促进血管新生，减少胶原纤维沉积，从而改善受体心脏的功能。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 同种异体骨髓间充质干细胞移植对扩张型心肌病心衰大鼠心功能的影响

前言

实验材料与方法

试验结果

讨论

结论

论文三 骨髓间充质干细胞移植对扩张型心肌病心衰大鼠心功能改善作用机制的研究

前言

实验材料和方法

试验结果

讨论

结论

本研究的创新性的自我评价

参考文献

综述 细胞移植治疗扩张型心肌病的研究现状

在学期间科研成绩

致谢

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