进展期胃上部癌局部浸润特点的分子病理学研究

摘要

前言:胃上部癌或称近端胃癌(proximal gastric cancer，PGC)，是发生于胃近侧1/3的癌，包括贲门癌和非贲门胃上部癌。近年来，无论在欧美还是在亚洲国家，其发病均呈明显上升趋势。胃上部癌具有明显不同于中、下部胃癌的临床病理特点，表现为病期较晚，侵袭范围广，恶性程度高，预后不良，手术后5年生存率仅为20％～35％。越来越多的学者主张将其作为一种不同于其他胃癌的独立疾病进行诊治和研究。
　　 浸润生长是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一。研究表明，胃上部癌比中、下部癌具有较强的近侧浸润倾向。癌细胞可沿粘膜或粘膜下直接向食管浸润，而食管-胃连接部(esophageal-gastric junction，EGJ)粘膜肥厚，淋巴管丰富，无幽门样屏障结构，利于癌细胞向近侧侵袭。对食管受侵程度估计不足是造成手术后癌残留的主要原因。文献报道，胃上部癌术后近侧切缘癌残留率达5％～10％，明显高于远侧切缘，而病灶的近侧浸润距离是确定手术径路和食管切除范围的重要依据，因此，多数学者集中在近侧浸润的研究，对远侧浸润特点及近、远侧浸润范围和程度的比较鲜有报道，且结论尚不一致。
　　 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)对细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的降解是肿瘤细胞实现浸润过程的重要前提。MMP-7是MMPs家族的重要成员，具有高度的蛋白降解能力和广泛的底物特异性，能高效降解Ⅳ型胶原、弹力素、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等多种ECM和基底膜成分，在胃肠癌等上皮来源的恶性肿瘤中呈高表达。文献报道，MMP-7表达强度与胃癌病灶的浸润能力呈正相关，认为它代表了肿瘤的浸润特征。S100A4是1989年发现的一种肿瘤转移相关基因，其编码蛋白属Ca2+结合蛋白S100家族的成员。研究证实，S100A4可通过多种机制，在多个阶段促进肿瘤的侵袭和转移，其过度表达被认为是肿瘤高侵袭能力的象征。
　　 本研究首先通过大切片方法比较进展期胃上部癌近、远侧浸润距离的差异，分析浸润范围和程度与胃癌病理因素的关系；进一步以RT-PCR和Western blot方法检测病灶近、远侧边缘和中央区的MMP-7、S100A4表达，研究其表达水平与胃上部癌生物学行为的关系，及其在癌浸润过程中的作用。
　　 材料与方法:
　　 1、研究对象
　　 收集42例原发性进展期胃上部癌手术切除标本，其中贲门腺癌27例，非贲门胃上部癌15例。所有患者术前未经化疗或放疗，病灶均为单发，术后上、下切缘病理切片检查除外癌残留。
　　 2、病灶标本收取和存放标本离体后，立即在肿瘤对侧剖开胃壁，将其充分伸展，沿纵轴于病灶近侧边缘、远侧边缘和中央区分别剪取瘤组织，并取未受累粘膜作为对照。组织存放于-80℃超低温冰箱中，用于RT-PCR和Western blot检测。沿病灶纵轴连续取材6-8条标本，每条宽约0.3cm，包括病灶近侧组织全长、病灶纵轴全长及远侧5.0-6.0cm组织。分别测量标本上缘至病灶上缘、标本下缘至病灶下缘的距离，然后将标本展开固定于木板上，浸入10％甲醛溶液固定48小时以上，用于制作癌浸润组织病理大切片。
　　 3、病理大切片制作及浸润距离测定取固定后条形标本，分别于病灶近、远侧边缘切断，将上、下两部分用于制作癌浸润组织病理大切片。切片厚度5μm，常规行HE染色，于光镜下以目镜测微尺测量并记录病灶边缘至癌细胞浸润最远处的垂直距离。根据同一组织在固定、脱水、包埋等过程中各部分均匀变化的原理，将切片测得浸润距离换算为离体后标本的实际浸润距离。
　　 4、RT-PCR检测组织匀浆后以TRIzol试剂提取细胞总RNA，通过逆转录反应将其转化为cDNA；以cDNA为模板，在反应体系中加入MMP-7或S100A4引物，以β-actin为内对照，进行PCR扩增；PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后分析图像，计算目的基因相对表达量。
　　 5、Western blot检测组织加入裂解液，匀浆后离心，取上清以酚试剂法检测蛋白浓度，并以最低浓度为基础将各样本蛋白浓度调整一致。每孔加样50μg，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后在转印槽中转膜，将硝酸纤维素膜封闭，加入MMP-7或S100A4或内对照β-actin兔抗人多克隆抗体，4℃孵育过夜。次日将膜置于碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(二抗)中，室温孵育2h，洗膜5min×3次，碱性磷酸酶显色液(AP)显色5min，沥干膜，扫描成像。以Scn image软件分析图像，计算蛋白相对表达量。
　　 结果:胃上部癌浸润以粘膜下直接浸润为主。42例标本的远侧浸润距离均在4.0cm以内；近侧浸润距离超过4.0cm者2例，均为Borrmann4型。近侧浸润距离明显超过远侧浸润距离(2.425cm Vs2.145cm，P<0.001).浸润距离与诸多病理因素相关，其中与病灶大小和大体类型的关系最为密切。
　　 MMP-7和S100A4在胃上部癌病灶表达水平明显高于对照粘膜(P<0.01)，而且病灶不同部位的表达存在显著差异；各因子表达水平由高至低的顺序相同，为：近侧边缘-远侧边缘-中央区。MMP-7表达与肿瘤病灶大小、大体类型、浸润深度和TNM分期密切相关；S100A4表达则与大体类型、浸润深度、淋巴转移和TNM分期密切相关。从部位上看，病灶边缘各因子表达水平与病理因素的关系比中央区更为密切。病灶边缘MMP-7 mRNA、MMP-7蛋白和S100A4 mRNA表达水平与相应浸润距离呈显著正相关，其中MMP-7蛋白表达与浸润距离的相关程度最为密切(r=0.354，P=0.001)；S100A4蛋白表达水平与浸润距离无显著相关。
　　 结论:
　　 1、进展期胃上部癌主要沿粘膜下层向周围浸润，其近侧浸润距离明显超过远侧浸润距离。
　　 2、进展期胃上部癌的局部浸润距离与诸多病理因素相关，与病灶大小和大体类型的关系最为密切。
　　 3、对病灶<5.0cm或局限型胃上部癌，近侧切断线可距病灶上缘3.0cm以内；而对≥5.0cm或浸润型胃上部癌，近侧切断线应距病灶上缘5.0cm。
　　 4、MMP-7和S100A4在胃上部癌病灶不同部位的表达水平存在显著差异，边缘表达高于中央区，提示病灶边缘是浸润、扩散的活跃部位。
　　 5、MMP-7和S100A4表达，尤其在病灶边缘的表达水平是评价胃上部癌生物学行为的可靠指标。
　　 6、病灶边缘MMP-7 mRNA和蛋白表达水平与浸润距离呈密切正相关，提示MMP-7是反映胃上部癌局部浸润行为的分子标志物之一。