Fn14影响TRAF1、TRAF2的结合调节NF-κB信号通路及乳腺癌细胞生物学行为

摘要

乳腺癌占所有女性肿瘤的25％，是迄今为止全球女性最常见的恶性疾病。致死原因大多是原发肿瘤细胞经血道或淋巴道转移至远处器官。基因特征已可以定义乳腺癌的生物学分类，但其侵袭转移的分子学基制还研究很少。最近研究发现纤维生长因子诱导14(Fibroblast growth factor inducible14，Fn14)是一种肿瘤特异的细胞表面标记物，已发现其在食管癌，肝癌，乳腺癌，神经胶质瘤中有异常高表达。肿瘤中Fn14基因激活的机制尚不明确。Fn14同其它肿瘤坏死因子受体(Tumor Necrosis Factor Receptor Associated，TNFR)超家族成员一样没有固有的蛋白激酶活性，但可以和接头分子结合，激活细胞内信号通路包括：NF-κB，JNK，ERK和p38活化。 肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor，TRAFs)就是一组参与TNFR超家族信号途径的接头分子，其中TRAFs(TRAF1，2，3，5)可分别连接到有重叠但不相同的鼠Fn14的胞质区。Fn14与TRAFs的作用机制尚无明确报道。已经有大量研究证实，在TRAFs家族所有成员中，TRAF1与TRAF2的关系最为密切。但是对于TRAF1，TRAF2的具体作用，一直存在着一些矛盾的观点。 目前尚无Fn14影响TRAF1，TRAF2结合从而影响NF-κB通路及乳腺癌细胞生物学行为的报道。我们研究发现乳腺癌细胞系中Fn14的表达可调节TRAF1，TRAF2的结合量及Fn14分别与TRAF1，TRAF2的结合量，影响NF-κB信号通路，同时调节乳腺癌细胞的增殖，凋亡，侵袭力。 材料与方法： 1、细胞：正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，人雌激素受体非依赖性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s用含有10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2的培养箱内培养。 2、转染：按照LipofectAMINE2000说明书操作。 3、免疫荧光：检测细胞中Fn14蛋白的表达。 4、RT-PCR：检测Fn14mRNA表达情况。 5、免疫共沉淀：检测Fn14、TRAF1、TRAF2蛋白之间的结合。 6、Western blot：检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s转染前后NF-κB信号通路的活化情况。 7、流式细胞仪检测：按照细胞凋亡与坏死检测试剂盒操作说明进行，Hoechst/PI双标后经流式细胞仪检测凋亡发生的比例。 8、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法：接种各组细胞至96孔培养板，培养24-120h，按照操作说明进行，用酶联免疫检测仪测量各孔在490nm处的吸光值(A490)，根据吸光值绘制细胞增殖曲线。 9、Transwell小室检测：接种各组细胞分别至Matrigel包被的含有微孔滤膜的Transwell小室，分别培养24h后，4％多聚甲醇固定，苏木素染色，显微镜观察细胞体外侵袭能力的变化。 10、使用SPSS14.0统计软件：进行数据处理，以p<0.05为有统计学意义。 结果： 1、转染pcDNA3.0-WT-Fn14上调TRAF1、TRAF2的结合，Fn14与TRAF1的结合，Fn14与TRAF2的结合，I-κBα的磷酸化水平 免疫共沉淀结果显示：转染pcDNA3.0-WT-Fn14的MDA-MB-435s细胞组TRAF1与TRAF2蛋白结合量明显增高，Fn14与TRAF1蛋白结合量，Fn14与TRAF2蛋白结合量明显增高，与未转染对照组比较差异均有统计学意义(p<0.05)。 Western blot显示：转染pcDNA3.0-WT-Fn14的MDA-MB-435s细胞组I-κBα的磷酸化水平增高。 2、转染Fn14SiRNA下调TRAF1、TRAF2的结合，Fn14与TRAF1的结合，Fn14与TRAF2的结合，I-κBα的磷酸化水平。免疫共沉淀结果显示：转染Fn14SiRNA的MDA-MB-231细胞组TRAF1与TRAF2蛋白结合表达量明显减低，Fn14与TRAF1蛋白结合量，Fn14与TRAF2蛋白结合量明显减低，与未转染对照组比较差异有统计学意义(p<0.01)。Western blot显示：转染Fn14SiRNA的MDA-MB-231细胞组I-κBα的磷酸化水平减低。 3、转染pcDNA3.0-WT-Fn14诱导细胞的增殖侵袭能力，抑制细胞凋亡。MTT法测定结果显示：pcDNA3.0-WT-Fn14质粒转染的细胞增殖能力明显高于空白对照组和lipo对照组(P<0.01)；而对照细胞间相比无明显差异(P>0.05)。流式细胞仪检测结果显示：转染pcDNA3.0-WT-Fn14组细胞凋亡率13.3±1.05％，明显低于对照组细胞41.5±2.15％(P<0.01)。Transwell侵袭试验结果显示：MDA-MB-435s细胞的侵袭相对数为18.7±3.5，转染pcDNA3.0-WT-Fn14的MDA-MB-435s细胞的侵袭相对数为67.0±2.6。转染pcDNA3.0-WT-Fn14组细胞的侵袭相对数明显高于对照组细胞，差异具有统计学意义(P<0.01)。 4、转染Fn14SiRNA抑制细胞的增殖侵袭能力，诱导细胞凋亡。MTT法测定结果显示：Fn14siRNA转染的细胞增殖能力明显低于空白对照组和lipo对照组(p<0.01)；而各对照细胞相比无明显差异(p>0.05)。流式细胞仪检测结果显示：转染Fn14siRNA组细胞凋亡率42.6±4.56％，明显高于对照组细胞54.0±3.7％(p<0.01)。Transwell侵袭试验结果显示：MDA-MB-231细胞的侵袭相对数为29±1.6，转染Fn14SiRNA的MDA-MB-231细胞的侵袭相对数为7.6±3.5。转染Fn14SiRNA组细胞侵袭相对数明显低于对照组细胞，差异具有统计学意义(p<0.01)。 结论： pcDNA3.0-WT-Fn14质粒能有效诱导MDA-MB-435s细胞中TRAF1与TRAF2的结合，Fn14与TRAF1的结合，Fn14与TRAF2的结合；上调I-кBα的磷酸化水平；并能促进肿瘤的增殖、侵袭，抑制细胞的凋亡。Fn14siRNA能有效抑制MDA-MB-231细胞中TRAF1与TRAF2的结合，Fn14与TRAF1的结合，Fn14与TRAF2的结合；下调I-кBα的磷酸化水平；并能抑制肿瘤的增殖、侵袭，促进细胞的凋亡，为乳腺癌的基因治疗提供了一种新策略。

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综述 TRAF1,2与Fn14的基础研究进展

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