应用Real-time RT-PCR进行胃癌腹膜亚临床转移相关标志物的检测

摘要

胃癌在我国具有很高的发病率，死亡率居恶性肿瘤之首。胃癌的主要治疗手段是根治手术，术后5年生存率约为40％，其中约30％～50％的患者发生腹膜转移，是导致患者死亡的重要原因。腹膜转移病灶一旦形成，即为临床转移，治疗则陷入十分困难的境地。 胃癌细胞脱落入腹腔后，其在腹腔内的生物学活动导致许多特异性分子标志物的产生，因此能够检测到这些特异性分子标志物的存在就证明了腹腔中脱落肿瘤细胞的存在。我们利用各种分子生物学方法在胃癌患者的腹腔冲洗液中检测与胃癌腹膜转移相关并能敏感表达的特异性分子标志物，以期提高脱落肿瘤细胞的检出率。但是，目前各种研究结果并不一致，哪种指标能够做为良好的检测标志物来切实有效的提高脱落肿瘤细胞的检出率，尚无法达成共识。近年来随着实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)的应用，能够实时定量检测到微量的mRNA，因而能够更准确的反映腹腔游离癌细胞的存在。 本研究选取与胃癌腹膜转移密切相关的8种分子生物学标志物，应用Real-Time RT-PCR方法对115例胃癌患者的腹腔冲洗液进行检测，另选取10例良性疾病患者的腹腔冲洗液作为阴性对照，对上述标志物进行检测，以期找出能够提高脱落肿瘤细胞检出率的指标，用以指导临床的诊断治疗。 材料与方法： 一、标本采集 收集中国医科大学附属第一医院肿瘤外科2007～2008年间胃癌患者腹腔冲洗液115例。 二、实验分组 根据腹腔冲洗液细胞学检查(PLC)诊断结果分组为：PLC(—)组、PLC(+)组、PLC(±)组及良性疾病腹腔冲洗液对照组。 三、提取腹腔冲洗液总RNA TRIZOL法提取胃癌腹腔冲洗液标本中的总RNA，取少量RNA用于含量及纯度测定，其余分装后置—80℃保存待用。 四、 Real-Time RT-PCR扩增各目的基因mRNA (一)应用反转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。 (二)Real-Time RT-PCR扩增各个分子指标，以β—actin做内对照。 (三)Rotor—Gene3000实时定量系统分析各基因表达情况。 五、统计学分析 实验数据应用软件SPSS13.0分析，选用X2检验、方差分析、Mann—Whitney检验及Kruskal—Wallis检验对数据结果进行分析。 结果： 一、PLC检查结果及分组 PLC(一)组：66例，57.3％(66/115)；PLC(+)组：31例，27.0％(31/115)；PLC(±)组：18例，15.7％(18/115)。 二、Real-Time RT-PCR检测腹腔冲洗液中各指标表达阳性率 CEA：39.1％(45/115)；DDC：34.8％(40/115)；HPA：33.0％(38/115)：MMP—7：31.3％(36/115)；Ki—67：30.4％(35/115)；TGF-β1：28.7％(33/115)；PCNA：25.2％(29/115)；L—3-PP：24.3％(28/115)。 三、ROC曲线分析各目的基因诊断价值 通过比较各指标ROC曲线下面积，各基因诊断价值顺序如下：CEA>DDC>HPA> MMP—7>Ki—67>TGF-β1>PCNA>L—3-PP。 四、各目的基因表达与胃癌腹膜转移相关临床病理因素比较 PLC结果阳性的31例病例中，各指标的阳性率依次为CEA93.5％(29/31)、DDC90.3％(28/31)、HPA87.1％(27/31)、MMP—777.4％(24/31)、Ki—6771.0％(22/31)、TGF-β161.3％(19/31)、PCNA54.8％(17/31)和L—3-PP45.2％(14/31)。其中CEA、DDC、HPA的表达阳性率要明显高于其他5种标志物(P<0.05)，显示了良好的敏感性。 肉眼腹膜转移阳性的14例病例中，各指标的阳性率依次为CEA100％(14/14)、DDC100％(14/14)、HPA92.9％(13/14)、MMP—778.6％(11/14)、Ki—6771.4％(10/14)、TGF-Pi64.3％(9/14)、PCNA64.3％(9/14)和L—3-PP57.1％(8/14)。其中CEA、DDC、HPA、MMP—7的表达阳性率要明显高于其他4种标志物(P<0.05)，显示了良好的敏感性。 CEA、DDC及HPA的表达与胃癌的浸润深度、浆膜类型、胃癌生长方式及胃癌的大体类型相关(P<0.05)。 结论： (1)CEA、DDC、HPA作为胃癌腹膜转移相关的3种标志物，用于胃癌腹膜转移的预测和腹膜亚临床转移的筛检，具有较好的灵敏性和特异性； (2)Real-Time RT-PCR作为一种监测胃癌腹腔脱落癌细胞的方法具有较好的灵敏性及特异性，有良好的应用前景； (3)CEA、DDC、HPA的表达与胃癌腹膜转移临床病理因素之间具有密切相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

声明

论文一　应用Real-time RT-PCR进行胃癌腹膜亚临床转移相关标志物的检测

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二　胃癌不同类型浆膜组织中各腹膜亚临床转移标志物表达情况的对比研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三　Real-time RT-PCR、半定量RT-PCR及PLC方法检测胃癌腹膜亚临床转移结果的对比研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述　胃癌腹膜亚临床转移基因诊断研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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