豚鼠离焦性近视眼巩膜Ⅰ型胶原、整合素α2、β1的表达及bFGF对近视形成的抑制作用

摘要

目的：
　　近年来，随着青少年近视眼发病率的不断升高，近视眼的预防和治疗治引起了全世界广泛的关注。动物实验性近视眼模型的建立，为近视眼的研究提供了有效的手段。用凹透镜模拟的视环境的改变可以短期内造成动物眼轴伸长，近视屈光度增加，建立光学离焦性近视眼模型，这种离焦性近视眼模型与人类近视眼的发病更加相似。研究表明，眼轴的伸长是巩膜组织的异常重塑的结果，因此，重视对实验性近视眼巩膜组织的研究，并找到有效的抑制细胞外基质异常重塑的手段，是近视眼防治切实可行的方向。Ⅰ型胶原是巩膜组织的最主要成分，以往对其研究多集中在合成和降解的改变，而另一种和胶原密切相关的基质成分——胶原结合整合素受体的研究少有报道。本实验建立豚鼠离焦性近视眼模型，检测整合素在巩膜的表达及在近视眼是否存在差异，并观察球周注射碱性成纤维细胞生长因子对近视形成的影响，探讨近视眼巩膜重塑的发病机制及防治手段。
　　方法：
　　实验一:
　　建立凹透镜诱导的豚鼠离焦性近视眼模型，观察视环境的改变即离焦与近视形成后的短期恢复对豚鼠屈光状态、眼轴长度的影响，以及巩膜组织形态学改变。
　　40只3周龄豚鼠，双眼屈光检查无近视状态，无明显屈光参差。随机分组:①光学离焦组:16只，右眼戴-7D镜片，为离焦组实验眼（16眼），戴镜14天;左眼不戴镜，自身对照眼（16眼）。②离焦后恢复组:16只，右眼为实验眼(16眼)，戴镜14天后，去除右眼镜片，自然视环境下饲养2天;左眼为自身对照眼（16眼）。③空白对照组:8只正常豚鼠，共16眼，不做任何处理，和实验组同周龄。
　　实验开始前双眼滴1％托吡卡胺滴眼液，待睫状肌麻痹后，行带状光检影验光。验光结束后，眼表面麻醉，使用A超仪测量双眼眼轴长度，测量从角膜顶点到眼球后极部玻璃体视网膜界面的距离。
　　PMMA镜片放于自制黏贴式尼龙扣中，粘贴于离焦组豚鼠右眼眼前。室内地面无限制饲养，光照周期约为14h/10h。14天后戴镜豚鼠右眼去除镜片，再次测量屈光度和眼轴长度，离焦组和空白对照组豚鼠处死，取材。恢复组去除镜片后，自然环境下饲养2天，第三次测量屈光度和眼轴长度，测量结束处死，取材。角膜缘后2mm处分割巩膜，取后部巩膜为检测对象。每组中处理因素相同的眼球，随机抽取2眼用于电镜标本制作，浸泡于2.5％戊二醛中固定;随机抽取2眼用于胶原特殊染色;6眼于眼球专用固定液中固定24小时，用于免疫组化染色;6眼迅速置于液氮罐中，用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的检测。
　　实验二:
　　第一部分实验中各组动物于设定实验时间处死，每组随机抽取6份巩膜样本行RT-PCR法检测各实验组后部巩膜中Ⅰ型胶原α1(1)链、整合素α2、β1及ILK的mRNA水平表达，6份用于免疫组化染色，检测整合素α2、β1及ILK在巩膜的定位及蛋白水平的表达。
　　实验三:
　　应用球周注射的方法，观察bFGF对豚鼠离焦性近视形成的抑制作用。42只3周龄三色豚鼠，随机分为4组:A:正常对照组，6只，12眼，与各实验组年龄匹配的正常豚鼠。B:光学离焦组，12只，右眼戴-7D镜片。C:光学离焦+PBS组，12只，右眼戴-7D镜片+隔日一次PBS球周注射。D:光学离焦+bFGF组，12只，右眼戴-7D镜片+隔日bFGF球周注射。实验时间为14天。
　　于实验开始前和结束时睫状肌麻痹后行带状光检影验光，A超仪测量双眼眼轴长度。
　　将rhbFGF溶于PBS缓冲液中，浓度为100ng/ml。C、D组豚鼠从右眼离焦的当天开始，隔日同一时段，氯胺酮75mg/Kg股部注射轻度麻醉后，分别球周注射bFGF和PBS缓冲液50μl。
　　实验结束后处死动物，小心剥离后部巩膜，每组随机各取6份用于RT-PCR检测Ⅰ型胶原α1链、整合素α2、整合素β1的mRNA水平表达。6份用于WesternBlot法检测蛋白表达。
　　统计学分析:
　　采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析:组间差异用one wayANOVA检验，两两比较采用LSD法检验;左右眼差异应用配对T检验比较。所有数据用((x)±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　实验一:
　　实验前3周龄豚鼠屈光度约为+3.00D远视，眼轴约7.3mm，各组间、组内双眼间屈光度、眼轴长度差异无统计学意义(P＞0.05）。
　　用-7D凹透镜经14天光学离焦可以造成豚鼠近视眼。实验眼呈中度近视状态，屈光度为-3.33±0.16D，与组内对照眼、空白对照眼比较，差异有显著性(P＜0.01）。离焦恢复组的实验眼在离焦恢复2天后屈光度为-2.48±0.19D，与恢复当天比较，屈光度减少，差异有显著性(P＜0.01）。
　　14天后，离焦组和恢复组的实验眼眼轴伸长，与各自对照眼比较，差异有显著性(P＜0.01）。离焦恢复组的实验眼去除镜片后在正常视环境下2天，与去除离焦时(14d)眼轴比较无变化(P＞0.05）。
　　巩膜形态学观察见离焦性近视眼豚鼠后部巩膜胶原纤维排列紊乱，巩膜变薄。电镜下胶原纤维密度减少，小直径胶原纤维增多，成纤维细胞形态不规则。
　　苦味酸-天狼猩红胶原染色显示Ⅰ型胶原主要分布于后极部，实验眼Ⅰ型胶原纤维密度减少，排列紊乱。
　　实验二:
　　免疫组织化学染色可见，豚鼠巩膜组织可见整合素β1、整合素α2和ILK的蛋白表达，于扁长形或梭形的成纤维细胞胞核周围，不规则的棕黄色着色。整合素β1、整合素α2和ILK在离焦组和恢复组的实验眼巩膜表达均减弱，与对照眼和正常眼比较差异有统计学意义(P＜0.05)。离焦恢复2天整合素β1、整合素α2和ILK蛋白表达较离焦组无差异。
　　Ⅰ型胶原α1(1)链、整合素β1、整合素α2和ILK在离焦组和恢复组的实验眼的mRNA水平表达下降，与自身对照眼比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)经过2天的恢复，可见整合素Ⅰ型胶原α1(1)链、整合素β1、整合素α2和ILKmRNA水平表达比离焦组实验眼有增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　实验三:
　　14天后，光学离焦组、光学离焦+PBS组、光学离焦+bFGF组豚鼠均出现单眼近视，PBS注射组的实验眼屈光度为-3.27±0.16D，眼轴长度为8.00±0.02mm，光学离焦组屈光度为-3.48±0.15D，眼轴长度为8.04±0.03mm，两组比较差异无统计学意义(P＞0.05）。bFGF球周注射组的近视屈光度为-1.46±0.11D，眼轴长度为7.71±0.02mm，和光学离焦组、PBS注射组比较，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。bFGF组的Ⅰ型胶原、整合素α2、整合素β1的mRNA和蛋白水平表达较光学离焦组、PBS注射组增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：
　　1、3周龄的豚鼠用-7D的凹透镜离焦14天可成功诱导出实验性轴性近视，实验眼的后极部巩膜变薄，胶原纤维排列紊乱，间隙变大，小直经纤维增多以及成纤维细胞的形态异常，表明实验性近视眼的形成是巩膜异常重塑的过程。
　　2、离焦诱导近视眼形成后去除镜片、经过2天的恢复，近视度数下降，进一步证实短期视环境改变即可引起屈光度变化，但眼轴长度没有改变，巩膜重塑导致的眼轴伸长短期内不能恢复。
　　3、豚鼠巩膜Ⅰ型胶原主要分布于后极部，Ⅰ型胶原的改变是近视眼巩膜重塑的重要因素。
　　4、豚鼠离焦性近视眼巩膜内整合素β1、整合素α2、ILKmRNA和蛋白表达水平下降，参与实验性近视眼巩膜重塑过程。去除离焦恢复2天后，巩膜内整合素β1、整合素α2、ILKmRNA水平表达回升，表明巩膜内整合素β1、整合素α2、ILK是巩膜重塑过程的早期调节因子。
　　5、外源性bFGF能够上调豚鼠实验性近视眼后部巩膜Ⅰ型胶原、整合素β1、α2表达，抑制豚鼠离焦性近视眼巩膜异常重塑，控制眼轴的伸长。
　　6、球周注射bFGF可以有效作用于豚鼠后部巩膜，抑制实验性近视眼的形成，证实巩膜是外源性bFGF作用的重要靶点。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 豚鼠光学离焦性近视眼模型的建立及短期恢复对屈光和眼轴的影响及巩膜组织形态学观察

前言

实验材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 豚鼠离焦性近视眼后部巩膜中Ⅰ型胶原、整合素α2、β1及ILK的表达

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 bFGF对离焦性近视眼形成的抑制作用及对Ⅰ型胶原、整合素α2、β1表达的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 实验性近视眼中巩膜重塑的研究进展

在学期间主要科研成绩

致谢

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