慢性铅暴露对小鼠学习记忆功能及大脑皮层神经元PI3K/PKB信号分子的影响

摘要

目的：铅是环境中一种具有很强神经发育毒性的毒物，即使是低水平暴露，仍然可以损害发育中的中枢神经系统，影响儿童的学习记忆能力和神经行为。由于儿童血脑屏障发育不完整，当血铅水平达到100μg/L时便能导致学习记忆及行为异常，引起儿童不可逆的神经系统损害。因此预防和治疗儿童铅中毒是涉及保护我国三亿儿童身心健康以及保证我国人民子孙后代富国强民的大事。目前铅致神经中毒机制仍不清楚。 蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)与蛋白激酶A和蛋白激酶C高度同源。因其与人类病毒癌基因V—Akt高度同源，故名Akt。PKB/Akt途径可激活多种底物，调节细胞的生存、分化、增殖和代谢等[1]。Erin等报道PKB/Akt也参与神经元及胶质细胞的存活、分化、凋亡等[2]。有研究指出[3]PI3K激活下游的PKB/Akt等参与海马CA1区LTP的表达，而与LTP的诱导无关。LTP表达是以AMPA受体功能持续增强为特点的。而且PI3K能促进膜上AMPA受体的功能加强与受体数量增加。PI3K是第一个发现的影响LTP表达的因子，为此其作用备受关注。 铅是环境中一种主要的、具有很强神经发育毒性的毒物，即使是低水平暴露，仍然可以损害发育中的中枢神经系统，影响人类的学习记忆能力和神经行为[4]。研究指出，多种蛋白激酶参与学习记忆过程。铅对小鼠大脑皮层神经元细胞PKB表达的影响未见报导。 本课题建立染铅小鼠动物模型，观察不同浓度铅对小鼠记忆行为(水迷宫、跳台试验)的影响；观察不同浓度铅对小鼠皮层神经元PI3K/PKB信号分子表达的影响，探讨PI3K/PKB信号分子与铅致神经系统学习记忆功能异常的关系，为探讨PI3K/PKB信号分子在神经元及胶质细胞的代谢、存活、分化、增殖、凋亡及LTP中的作用机制奠定基础。 方法：昆明系小鼠由中国医科大学实验动物中心提供。按每笼雄：雌为1：2自然交配，随机分为五组，依次分为对照组和2.4、4.8、7.6、9.mmol/L醋酸铅组。从出生第一天起开始通过饮水饲以不同浓度醋酸铅水溶液。对照组饮用自来水。低、中、高剂量铅中毒组饮用含2.4、4.8、7.6、9.6mmol/L醋酸铅水溶液。自第21d起，幼鼠开始自己饮用与其母鼠相同的饮用水。于出生后第42d解剖动物取出大脑皮层，放入液氮中，转存到—70℃冰箱中。第42d开始进行水迷宫和跳台实验，观察铅对小鼠学习记忆功能的影响。 取对照组与染铅组小鼠大脑皮层标本，利用PI3K和PKB多克隆抗体，经Western blot方法测定PI3K和PKB在皮层神经元的表达。证明铅是通过影响P13K和PKB表达而学习记忆功能的，为揭示老年痴呆症等发病机制提供新的研究方向。 结果： 1、慢性铅暴露对小鼠血铅和脑铅含量的影响 小鼠出生后42d进行血铅和脑铅含量进行测定，各慢性染铅组小鼠血铅和脑铅含量均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，升高的程度与饮用水的铅浓度呈正相关。9.6mmol/L醋酸铅组明显高于2.4mmol/L醋酸铅组。差异有统计学意义。 2、慢性铅暴露损伤小鼠空间学习记忆及被动回避反应学习记忆能力 在水迷宫实验中，结果表明慢性铅暴露可明显损伤小鼠的空间学习记忆能力，损伤程度与饮用铅的浓度成正相关； 在跳台试验中，结果表明慢性铅暴露可明显损伤小鼠的被动回避反应的获得与保持能力，其损伤程度亦与饮用铅的浓度成正相关。 3、慢性铅暴露对小鼠大脑皮层神经元细胞PI3K/PKB信号分子的影响 蛋白免疫印迹检测结果显示：4.8、9.6mmol/L醋酸铅组鼠脑海马PI3K蛋白的表达与相应期对照组相比较差异有统计学意义(P<0.01)。Pearson相关分析显示，PI3K表达与血铅浓度呈负相关(γ=-0.82，P<0.01)，即血铅、脑铅的浓度越高，PI3K表达降低越明显。PI3K表达与学习记忆能力损伤程度比较呈负相关(r=-0.671，P<0.01)，即p-PKB表达降低越明显，损伤程度越严重。 与对照组相比，染铅组的总量PKB蛋白(t-PKB)与对照组相比无显著统计学差异(P>0.05)。染铅组p-PKB表达有显著性降低(P<0.01)，并呈浓度依赖性。染铅组的总量PKB蛋白与对照组相比无显著统计学差异(P>0.05)。Pearson相关分析显示，p-PKB表达与血铅浓度呈负相关(γ=-0.82，P<0.01)，即血铅、脑铅的浓度越高，p-PKB表达降低越明显。p-PKB表达与学习记忆能力损伤程度比较呈负相关(γ=-0.671，P<0.01)，即p-PKB表达降低越明显，损伤程度越严重。 结论： 1、慢性染铅使小鼠血铅和脑铅含量均明显高于对照组，升高的程度与饮用水的铅浓度呈正相关。 2、慢性铅暴露可明显损伤小鼠的空间学习记忆能力。学习记忆能力损伤程度与血铅、脑铅的浓度呈正相关，即随血铅、脑铅的浓度升高，空间学习记忆损伤程度越严重。 3、慢性铅暴露导致小鼠大脑皮层神经元PI3K、p-PKB的表达降低，而不影响t-PKB的表达。慢性铅暴露时PI3K/PKB信号转导途径表达降低，进而损伤LTP，导致学习功能异常。这可能是铅致小鼠学习记忆功能紊乱的机制之一。

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综述 铅暴露对学习记忆过程中蛋白激酶的影响

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