糖基化终末产物及Probucol对大鼠心脏微血管内皮细胞eNOS脱偶联和内皮祖细胞的增殖、凋亡及管腔形成作用的研究

摘要

前言：大量证据表明，体内糖基化终末产物(Advanced glycaton end products，AGEs)的不断累积与心血管疾病的发生发展关系密切。AGEs与AGE受体(receptor forAGE，RAGE)相互作用可诱导活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生，从而引发氧化应激。
　　 有证据表明，AGEs诱导的氧化应激是糖尿病性心肌病重要的促发因素。而现在的研究认为，糖尿病性心肌病实质是一种微血管病变，更为重要的发病机制是微血管舒张功能障碍而引发的组织缺血。NO是保持血管组织舒张功能的重要因子，在糖尿病状态下，血管组织中eNOS脱偶联是导致NO生成减少的主要机制，致使血管组织舒张功能受损、组织缺血而引发一系列疾病。
　　 现在的观点认为，组织中氧化应激的爆发是eNOS脱偶联发生的最主要原因。关于其具体机制，有研究者认为依赖PKC的NADPH氧化酶激活在介导糖尿病患者内皮细胞氧化应激发生和并发症形成中起重要作用。Warboys CM最新研究发现，AGEs可以通过RAGE激活PKC，从而使肾脏微血管内皮细胞内的NADPH氧化酶表达增加。而NADPH氧化酶使细胞内ROS增加，ROS又能导致eNOS脱偶联的发生，进而引起内皮细胞功能紊乱。
　　 然而，糖尿病性心肌病作为一种心脏微血管病变，AGEs是否引起心脏微血管内皮细胞内的ROS产生增加从而引起eNOS脱偶联及其分子机制仍然不清晰。以往的实验研究采用大血管内皮细胞功能紊乱来阐述糖尿病心肌病的发病机制，这种准确性尚存在质疑。因此，本实验将心脏微血管内皮细胞作为研究主体，观察AGEs作用下心脏微血管内皮细胞内是否出现eNOS脱偶联现象以及PKC/NADPH氧化应激途径在其中的作用。
　　 另外，现在的研究认为，普罗布考(probucol)很可能通过对抗氧化应激损伤的机制，显著提高内皮依赖性的血管舒张功能，改善内皮功能障碍，因此在治疗糖尿病微血管并发症领域有广阔的前景。本实验同时观察普罗布考能否通过抑制eNOS脱偶联的机制达到缓解内皮细胞功能紊乱、预防糖尿病性心肌病的作用。
　　 大量的证据表明，EPCs构成重要的内生系统以保持血管内皮的完整性和血管内环境的稳定，同时EPCs数量的减少也可以预测心血管疾病的发生。体外实验和临床研究显示，氧化应激也会影响EPCs动员，从而破坏血管内皮的完整和内环境的稳定。对氧化应激导致EPCs数量和功能异常的机制的了解，将会为理解心血管疾病的发病机制提供独特的视角，并为临床治疗提供新的靶点。因此，本实验要将EPCs作为研究主体，观察AGEs对其增殖、凋亡和管腔形成能力的影响，另外观察普罗布考是否具有保护EPCs的作用。
　　 实验方法：
　　 一、大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养及鉴定20-30g Wistar胎大鼠取心脏组织，剪碎，0.1％Ⅱ型胶原酶和0.05％胰蛋白酶消化培养法进行原代培养。采用第3-5代细胞进行实验。内皮细胞鉴定：荧光显微镜下观察抗Ⅷ因子抗体结合情况。
　　 二、EPCs原代培养及鉴定采用Ficoll密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法从大鼠骨髓分离EPCs；收集培养5d的EPCs，用激光共聚焦显微镜观察，AC133和vWF双染阳性细胞为正在分化的EPCs。
　　 三、AGEs的制备20g/L，BSA与500mmol/L，葡萄糖溶于PH7.4 PBS中混匀，并加入终浓度为0.5mmol/L的EDTA，室温放置过夜。0.2μm滤器过滤，灭菌封口后放置37℃避光孵育90d取出，荧光光谱扫描检测制备的BSA-AGEs。实验前用PH7.4 PBS透析去除未结合的葡萄糖及EDTA。
　　 四、实验分组
　　 对照组、AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分别作用(0h，6h，12h，24h)组、AGEs100mg/L+LY33531(2.5μM，5μM，10μM)组、AGEs100mg/L+DPI(2.5μM，5μM，10μM)组和AGEs100mg/L+probucol(5μM，10μM，20μM)组。对照组加无血清培养液培养。
　　 五、ROS测定采用2’，7’二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光染色检测ROS。DCFH-DA本身没有荧光，但可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。用无血清的培养基清洗细胞两次，再加入DCFH-DA(1:1000稀释)，37℃孵育箱中孵育20mins后胰酶消化，1ml无血清的培养基重悬细胞，荧光显微镜观察细胞内ROS的荧光强度。
　　 六、NO、O2-测定24孔板培养细胞，无血清培养基孵育24h后，按照实验分组加入无血清培养基配置的刺激因素(LY33531、DPI和probucol)30mins后，各孔加AGEs100mg/L继续孵育24h，收集上清液备用测定NO和O2-。具体步骤按照试剂盒说明书操作，721分光光度计测定各组吸光度。
　　 七、HPLC法测定BH4分别对酸性条件下氧化和碱性条件下氧化的标本进行测定。酸性条件下氧化的标本检测出总生物喋呤包括BH4、BH2(二氢生物喋呤)和B(氧化型生物喋呤)；在碱性条件下氧化的标本可以检测BH2和B。将BH2和B从总生物喋呤中除去即BH4含量。
　　 八、免疫组化法测定eNOS及RAGE的表达在放有玻片的24孔板中培养细胞，无血清培养基孵育24h后，各组加入刺激因素24h，取出玻片，4％多聚甲醛固定30mins后，5％BSA封闭30mins加入一抗，室温30mins后加入二抗，DAB染色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明后树胶封片。
　　 九、Western blot测定p47phox表达刮下25cm2培养瓶中细胞，5000rpm离心收集细胞，-70℃保存备用。配置4％浓缩胶及8％分离胶，竖板电泳仪上电泳90mins，PVDF转膜45mins，5％脱脂奶粉封闭2h，1:500比例稀释一抗，4℃过夜，二抗(1:2000)室温孵育2h，DAB染色。
　　 十、MTT检测EPCs增殖消化收集贴壁EPCs；以5×103/孔的细胞数接种于96孔板中，每孔体积200μl；放入37℃、5％CO2的孵育箱内培养2h；待细胞基本融合，加入无血清DMEM作用12h；加入刺激因素；检测时，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)孵育4h，吸除孔内液体，每孔加入150μlDMSO，微量振荡器震荡10min，置酶标仪测定OD490值。
　　 十一、EPCs管腔形成的检测以5×105/孔的细胞数接种于涂有Matrigel的24孔板内培养24h；加入不同浓度AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分别作用不同时间点(6h，12h，24h)；在100倍倒置相差显微镜下随机选取3处管腔密集的视野计数管腔数。
　　 十二、AnnexinAv-PI流式细胞分析法检测EPCs凋亡0.25％胰蛋白酶消化收集贴壁EPCs，用含2％BSA的PBS终止反应，1000rpm离心5mins，弃上清，重复两次，弃上清，加入500μl banding buffer，静置，混匀后加入5μlAV，静置，再加入5μl PI。同时准备无AV/PI、只加AV、只加PI三管做空白对照，流式细胞仪检测结果。
　　 实验结果：
　　 一、心脏微血管内皮细胞鉴定原代细胞培养7d后，呈单层铺路石样生长。采用Ⅷ因子鉴定，细胞浆及细胞膜均着红色荧光，证明培养的细胞为心脏微血管内皮细胞。
　　 二、AGEs对心脏微血管内皮细胞内eNOS脱偶联的影响
　　 (一)AGEs引发的心脏微血管内皮细胞NO、O2-生成变化不同浓度AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分别作用心脏微血管内皮细胞不同时间(6h，12h，24h)，NO、O2-生成与AGEs存在量效和时效关系(P<0.01)；
　　 (二)AGEs引发的心脏微血管内皮细胞eNOS的表达、BH4含量的变化不同浓度AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分别作用心脏微血管内皮细胞不同时间(6h，12h，24h)，eNOS表达和BH4含量与AGEs存在量效和时效关系(P<0.05)。
　　 三、PKC/NADPH氧化应激途径对eNOS脱偶联的影响
　　 (一)AGEs引发的心脏微血管内皮细胞ROS生成的变化及PKC/NADPH氧化酶对其的影响不同浓度AGEs(50mg/L，100mg/L，200mg/L)分别作用心脏微血管内皮细胞不同时间(6h，12h，24h)，ROS表达与AGEs存在量效和时效关系(P<0.05)；应用DPI(5μM，10μM，20μM)后，ROS逐渐降低(P<0.05)；应用LY33531(5μM，10μM，20μM)浓度的增加，ROS表达均减少(P<0.05)。
　　 (二)PKC/NAPH氧化应激途径对AGEs诱导心脏微血管内皮细胞NO、O2-生成变化的影响心脏微血管内皮细胞用PKC特异性抑制剂-LY33531(5μM，10μM，20μM)作用30mins后，加入AGEs(100mg/L)再孵育24h，无血清培养基处理组做空白对照。随着LY33531浓度的增加，NO生成逐渐增家(P<0.05)，而O2-生成逐渐减少(P<0.05)。用NADPH氧化酶抑制剂-DPI(5μM，10μM，20μM)分别作用心脏微血管内皮细胞30mins后，加入AGEs(100mg/L)再孵育24h，观察各组NO、O2-生成的变化。随着DPI浓度的增加，NO生成增加(P<0.05)，而O2-生成减少(P<0.01)。
　　 (三)PKC/NADPH氧化应激途径对AGEs诱导心脏微血管内皮细胞eNOS的表达、BH4含量变化的影响应用DPI(5μM，10μM，20μM)后，eNOS表达逐渐减少(P<0.05)，BH4随着DPI浓度增加而增加(P<0.05)随着LY33531(5μM，10μM，20μM)浓度的增加，eNOS表达逐渐减少(P<0.05)，而BH4含量逐渐增加(P<0.05)。
　　 (四)PKC对AGEs诱导心脏微血管内皮细胞p47phox表达的影响p47phox表达在AGEs组较空白组明显增加(P<0.01)，ROS表达增加(P<0.01)；随着LY33531(5μM，10μM，20μM)浓度的增加，p47phox表达减少(P<0.05)。
　　 五、probucol对AGEs诱导心脏微血管内皮细胞eNOS脱偶联及PKC/NADPH氧化应激途径的影响
　　 (一)probucol对AGEs诱导心脏微血管内皮细胞NO、O2-生成变化的影响用probucol(5μM，10μM，20μM)分别作用细胞30mins后，加入AGEs(100mg/L)再孵育24h，无血清培养基处理组做空白对照。随着probucol浓度的增加，NO生成增加(P<0.05)，而O2-生成减少(P<0.05)。
　　 (二)probucol对AGEs诱导心脏微血管内皮细胞BH4、eNOS表达的影响probucol增加细胞内BH4含量及eNOS表达(P<0.05)。
　　 (三)probucol对AGEs诱导心脏微血管内皮细胞ROS和p47phox的表达的影响Probucol能够明显降低细胞内ROS与p47phox蛋白的表达(P<0.05)。
　　 (四)probucol对AGEs诱导心脏微血管内皮细胞RAGE的表达的影响Probucol能够明显降低细胞RAGE的表达(P<0.05)。
　　 六、EPCs的鉴定原代培养24h后，细胞大部分呈小圆形；差速贴壁筛选后，培养一天可见少量细胞贴壁；3d后细胞开始伸展成梭形或纺锤形。AC133、vWF双阳性荧光染色为正在分化的EPCs。
　　 七、AGEs对EPCs增殖、凋亡及管腔形成的影响AGEs影响EPCs的增殖能力，具有剂量和时间依赖性。同一时间，随浓度增加其影响作用更强(P<0.01)。相同浓度，在6-24h期间，随时间延长，AGEs减缓EPCs增殖的速度(P<0.01)；AnnexinV/PI流式细胞分析法检测结果显示，随着AGEs浓度的增加和作用时间的延长，EPCs总凋亡率亦显著增加(P<0.01)；体外管腔形成实验结果显示，AGEs显著降低EPCs体外管腔形成能力，200mg/L最为显著(P<0.01)。
　　 八、probucol对EPCs增殖、凋亡和管腔形成的影响不同浓度probucol(5μ M，10μ M，20μ M)孵育30mim后，100mg/LAGEs继续作用24h，观察EPCs的增殖、凋亡和管腔形成能力。结果显示probucol恢复AGEs对EPCs增殖能力降低的影响，降低细胞凋亡数，增加管腔形成数目，均有显著性的差异(P<0.01)。
　　 结论：
　　 1、AGEs能够引发大鼠心脏微血管内皮细胞eNOS脱偶联。
　　 2、AGEs可能通过PKC/NADPH氧化应激途径引发大鼠心脏微血管内皮细胞eNOS脱偶联。
　　 3、Probucol可能通过抑制PKC/NADPH氧化应激途径，从而阻断eNOS脱偶联的发生，达到抑制AGEs引发氧化应激的目的。
　　 4、AGEs可能通过促进EPCs凋亡，抑制其增殖及管腔形成能力，从而影响糖尿病时EPCs修复受损血管的能力。
　　 5、Probucol可以抑制AGEs引发的EPCs凋亡，恢复其增殖及管腔形成能力。