AT1受体抑制剂对雌激素作用下的子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

摘要

无孕激素拮抗的高水平雌激素长期刺激与子宫内膜癌发病关系密切,对于雌激素诱发子宫内膜癌的机制研究更多围绕其受体依赖作用,而对雌激素非受体依赖作用研究较少。现有研究证实血管紧张素Ⅱ受体1(AT1-R)可以激活雌激素受体(-)的SKBR3乳腺癌细胞系中MAPK的活性,促进乳腺癌细胞增殖,所以我们推测雌激素是否能够通过AR1-R促进雌激素受体(ER)低表达的子宫内膜细胞增殖。本研究从子宫内膜癌发病中雌激素的非受体依赖机制这一新方向着手,探讨雌激素是否能够通过AT1-R而不依赖于ER诱导子宫内膜癌细胞凋亡抑制,从全新角度研究雌激素在子宫内膜癌发生过程中的分子机制,同时找到拮抗这种分子机制的方法,渴望能通过控制雌激素非受体依赖性作用,最终抑制细胞周期的进展,为ER低表达的子宫内膜癌的治疗提供新的理论依据和治疗靶点。
　　 目的：
　　 本实验采用免疫细胞化学方法,MTT法、流式细胞技术及免疫印迹研究子宫内膜癌HEC-1A细胞中AT1-R、PI3K、p-Akt、ERK蛋白的表达及其相关性,探讨雌激素(E2)及AT1-R抑制剂saralasin对HEC-1A细胞的增殖、细胞周期和凋亡的影响。
　　 材料与方法：
　　 1、主要材料与仪器
　　 HEC-1A细胞株；胎牛血清；McCoy’s 5a培养基；水溶性17β-雌激素；AT1-R抑制剂saralasin和雌激素受体抑制剂ICI182780;兔抗人AT1-R抗体、PI3K抗体、p-Akt抗体及ERK抗体;山羊抗兔FITC荧光标记二抗；碘化丙啶(PI)；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG；超净工作台；二氧化碳恒温培养箱;倒置相差显微镜；激光共聚焦显微镜观察；分光光度计；流式细胞仪;超速低温离心机；电泳仪；转印槽；自动凝胶成像分析仪
　　 2、实验方法
　　 将HEC-1A细胞置于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的McCoy’s 5a培养液中,于37℃、5％CO2培养箱中培养,使其贴壁生长。细胞长满95％以上后用0.25％胰酶进行消化传代。
　　 应用免疫细胞化学方法检测AT1-R、PI3K、p-Akt、ERK蛋白在HEC-1A细胞中的表达；应用MTT法、流式细胞技术检测雌激素作用于HEC-1A细胞不同时间后细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化,以及saralasin对雌激素诱导下的HEC-1A细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响；Western blot分析雌激素作用后HEC-1A细胞中的ERK、p-Akt蛋白表达的变化,及saralasin对雌激素诱导下的HEC-1A细胞中ERK、p-Akt蛋白表达的影响。
　　 3、统计学分析
　　 采用SPSS 13.0软件对数据进行处理,应用方差分析,LSD-t检验进行组间比较,数据以(x)±s表示,取P<0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、AT1-R、PI3K、p-Akt及ERK蛋白在HEC-1A细胞中的表达
　　 激光共聚焦显微镜观察AT1-R、PI3K、ERK、p-Akt蛋白在HEC-1A细胞中的表达情况,结果发现AT1-R、PI3K、ERK蛋白主要在细胞质中表达,p-Akt蛋白主要在细胞核中表达。
　　 2、雌激素及saralasin对HEC-1A细胞增殖的影响
　　 MTT结果提示在药物作用5min、10min、15min时E2对HEC-1A细胞具有促增殖作用；在药物作用10min时,saralasin对HEC-1A细胞有明显的抑制作用；在药物作用各时间段内,ICI182780对HEC-1A细胞均无明显的抑制作用。
　　 3、雌激素及saralasin对HEC-1A细胞周期和凋亡的影响
　　 流式细胞技术检测结果发现雌激素作用10min后HEC-1A细胞的G0～G1期细胞比例下降,S期的比例升高；saralasin作用于雌激素诱导的HEC-1A细胞10min后,其G0～G1期细胞的比例升高,S期细胞的比例相对下降,同时促使HEC-1A细胞发生凋亡,以晚期凋亡为主；而ICI182780作用于雌激素诱导的HEC-1A细胞10min后,对HEC-1A细胞的细胞周期及促凋亡作用不明显。
　　 4、雌激素及sarallasin对HEC-1A细胞中ERK、p-Akt蛋白表达的影响
　　 Western blot结果提示雌激素处理10min后,HEC-1A细胞中ERK1/2蛋白的表达明显上调；Saralasin作用10min后可使雌激素诱导的HEC-1A细胞中ERK1/2蛋白的表达明显下调；而ICI182780作用HEC-1A细胞10min后ERK1/2蛋白的表达下调不明显。各处理因素作用后HEC-1A细胞中p-Akt蛋白的表达无明显差异。
　　 结论：
　　 1、雌激素对HEC-1A细胞具有促增殖作用,而雌激素受体抑制剂ICI182780对雌激素诱导的HEC-1A细胞增殖、细胞周期以及细胞凋亡没有明显作用,提示雌激素对HEC-1A细胞的促增殖作用是ER非依赖性的。
　　 2、AT1-R在HEC-1A细胞中高表达,抑制AT1-R后,HEC-1A细胞增值率明显下降,凋亡率增加,细胞周期停滞在G0～G1期,ERK1/2蛋白的表达明显下调,所以我们推测雌激素可能通过AT1-R促进HEC-1A细胞增殖,其作用机制可能是通过激活MAPK信号传导途径来实现的。
　　 3、ICI182780对ER低表达的子宫内膜癌细胞HEC-1A无明显的抑制作用,而AT1-R抑制剂Saralasin对HEC-1A细胞增殖有明显的抑制作用,对于雌激素受体低表达的子宫内膜癌,AT1-R拮抗剂如果能够作为抗该类子宫内膜癌药物的新的靶向疗法将会是具有良好前景的治疗策略。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

参考文献

在学期间科研成绩

致谢

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