辽宁MSM人群HIV-1感染早期病毒env准种演变与疾病进展关系的研究

摘要

目的：
　　 本研究以人免疫缺陷病毒（HIV-1）原发感染患者为研究对象，以前瞻性队列研究的方式，高密度随访观察感染早期病毒复制水平的动态变化，以HIV-1基因组中膜蛋白编码区gp160为研究目标，经TA克隆的方法获取感染后最早时间点和病毒调定点时期的准种序列，进行个体内病毒N-糖基化位点、辅助受体、遗传多样性、趋异性、特征性氨基酸变异及不同时间点的上述病毒特征演变分析，并分析上述各项指标与病毒调定点高低的关系，以期从分子水平探讨HIV-1患者病毒调定点的形成机制，揭示HIV-1感染早期病毒的生物学特征、寻找保护性免疫应答的相关因素，为HIV感染的治疗和疫苗设计提供新的思路。
　　 方法：
　　 1、研究对象
　　 12例未经抗病毒治疗原发感染病例，分析并比对每例原发感染者最早时间点及setpoint点病毒env基因的变化。并根据HIV-1感染后4-24月内，病毒载量相对稳定，定义病毒载量调定点的时间。根据setpoint点病毒载量水平分为高setpoint组（>4 log10copies/mL）和低setpoint组（<4 log10copies/mL）。
　　 2、CD4+T淋巴细胞测定
　　 20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，用FACS MMLTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。
　　 3、病毒载量测定
　　 以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor 1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为400-750，000copies/ml。
　　 4、病毒核酸提取、RT-PCR
　　 以抗凝140μl血浆提取病毒基因组RNA，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书步骤提取RNA，提取物溶于60μl洗脱液中。RT反应体系基于SuperScript○RⅢReverse Transcriptase Kit（invitrogen）
　　 5、巢氏聚合酶链反应（nest-PCR）
　　 以外侧引物对：AEOF（5’-TAGAGCCCTGGAATCATCCGGGAAG-3’HXB25853-5877nt）和AEOR（5'-TTACTACTTGTTACTGCTCCATGT-3’HIV-1 HXB28936-8913nt）；内侧引物对：UIF（5’-CACCTTAGGCATCTCCTATGGCAGG AAGAAG-3'HIV-1HxB27850-7879nt）和AEIR（5’-AGCTGGATCCGTCTTGAGATA CTGCTCCTAC-3'HIV-1HXB28914-8884nt），用于扩增HIV-1 gp160序列。
　　 6、PCR反应产物纯化
　　 取终产物5m进行1％琼脂糖凝胶电泳，经Ultra-Violet Product凝胶成像后与marker比对，确认所需片段，用QIAquik Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。
　　 7、TA克隆
　　 扩增的gp160基因3000bp片段插入克隆载体pMDTM18-T Simple Vector，转入化学感受态菌DH5a扩大培养，然后提取质粒DNA双脱氧终止法测序。
　　 8、序列分析
　　 经PCR扩增和测序得到HIV-1 gp41基因的基因序列片段，然后用Contig软件进行拼接，用BioEdit软件进行序列比对。用MEGA 3软件的进行系统树分析，并计算基因离散率及趋异性。使用网上工具（http：//www.hiv.lanl.gov）分析同义替代及非同义替代、Highlighter、N-Glycosite site。利用网络工具IEDB Analysis Resource，根据本实验室前期获得的患者HLA-Ⅰ等位基因分型信息，预测样本的HLA-Ⅰ限制性CTL表位，选取IC50低于50nM的表位进行多肽特征和变异分析。使用Simplot软件进行重组断点分析。使用Geno2pheno[coreceptor]软件，进行细胞嗜性的预测。
　　 9、统计学分析
　　 用SPSS15统计软件进行统计分析；数据使用均数±标准差及中位数±95％可信区间；用non-parametric Wilcoxon rank-sum test分析不同时间点毒株的PNGs数量和env区变异环长度的不同；用Spearman秩相关进行相关性分析；p<0.05为有统计学意义。
　　 结 果：
　　 一、膜蛋白基本特征
　　 1、env变异环的长度分析
　　 在感染最早期，高病毒setpoint组V1、V2、V4区长度有高于低病毒setpoint组趋势，而v5区长度有低于低病毒setpoint组趋势，但上述差异均未达显著性水平；在setpoint点，两组上述各区域的变化仍未发生显著性差异。
　　 两组随着时间的推移各区的变化如下：在V1区，高病毒setpoint组无明显变化，低病毒setpoint组V1有变短趋势；V2区与V3区两组均无明显变化；V4区与V5区两组均有变短趋势，但差异均未达显著性水平。
　　 2、N-糖基化位点（PNGs）
　　 在感染最早期，高病毒setpoint组V1、V2、V5区PNGs数量有低于低病毒setpoint组趋势，而V3、V4区、gp41胞外区PNGs数量有高于低病毒setpoint组趋势，但上述差异均未达显著性水平；在setpoint点，两组在上述各区域的PNGs数量上仍无显著性差异。
　　 两组随着时间的推移各区的变化如下：在高病毒setpoint组与低病毒setpoint组中V1区与V4区的PNGs均有减少趋势；在V2区和gp41胞外区，高病毒setpoint组PNGs数量有增加趋势，低病毒setpoint组则有减少趋势；在V3区，高病毒setpoint组的PNGs数量无明显变化，低病毒setpoint组则有增加趋势；在V5区，高病毒setpoint组的PNGs数量有减少趋势，低病毒setpoint组则有增加趋势，但上述差异均未达显著性水平。
　　 3、细胞嗜性预测结果
　　 12例HIV-1原发感染者感染毒株在感染早期以CCR5嗜性的病毒株为主，占83.3％，高病毒病毒setpoint组病毒准种全部为CCR5嗜性，低病毒setpoint组50％的感染者准种为CXCR5。1例经异性性传播感染者在感染早期病毒准种为CCR5嗜性，但其setpoint时的病毒准种转变为CXCR4嗜性。
　　 二、HIV-1 env进化特征
　　 1、同一感染者个体内最早期和调定点的病毒多样性分析
　　 按照Fiebig分期比较，Ⅱ期时，高病毒setpoint组多样性低于低病毒setpoint组；而在Ⅳ与Ⅳ期，高病毒setpoint组多样性高于低病毒setpoint组。
　　 2、多样性率
　　 高病毒setpoint组多样性率与低病毒setpoint组多样性率无显著性差异（p=0.458）
　　 3、核苷酸趋异性和氨基酸趋异性分析
　　 高病毒setpoint组趋异性有高于低病毒setpoint组的趋势（P=0.105）。线性回归模型提示基因距离与VL的对数呈正相关（r=0.162，p=0.157）。高病毒setpoint组比低病毒setpoint组具有较高的氨基酸趋异性（p=0.157），与基因趋异性具有相同的特点。
　　 4、dN/dS ratios
　　 高病毒setpoint组dN/dS显著高于低病毒setpoint组（p=0.002）；同时我们发现高病毒setpoint组dS同样高于低病毒setpoint组dS（p<0.001）。而高病毒setpoint组dN和低病毒setpoint组dN具有相似性（P=0.308）。
　　 5、不同感染者体内同源病毒进化差异的研究
　　 通过流行病学及全长env基因分析发现12例原发感染者中存在2对同源传播对，其中一对为高度同源株单一病毒株传播，而另外一对情况较复杂，其中一例为单一病毒株传播，另一例则感染了2株病毒，其感染先后时序不明。
　　 结论：
　　 1、辽宁MSM人群HIV-1 AE亚型原发感染者，单一病毒株的感染比较普遍。同时，我们也发现了一例2种毒株感染的个体。
　　 2、原发感染者，setpoint点和最早期相比，变异环长度和PNGs数量没有变化或者变化较小，两组没有显著性差别。
　　 3、原发感染者，个体内最早期的病毒多样性，因感染早期所处的Fiebig分期不同而不同；且setpoint点病毒载量水平与病毒趋异性相关。
　　 4、Setpoint点，dN/dS、dS与病毒载量呈正相关，两组具有显著性差别。

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结论

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