小鼠皮肤切创愈合过程中M型胆碱能受体表达及其与损伤时间相关性的研究

摘要

目的：
　　 皮肤损伤愈合是一个复杂的过程，包括血液成分凝集、炎症反应、肉芽组织形成、新生上皮覆盖、结缔组织收缩和纤维化等过程。迷走神经递质乙酰胆碱可被非神经细胞（如角质形成细胞、内皮细胞、黑色素细胞等）合成并通过自分泌、旁分泌及内分泌等方式参与皮肤的许多基本功能，如增殖、分化、粘附和迁移，微循环，血管发生及许多免疫反应。实验表明，参与皮肤损伤愈合的中性粒细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及内皮细胞等均发现非神经胆碱能系统或其组成成分。M3R（M3 subtypes of muscarinic receptor）是毒蕈碱乙酰胆碱受体的一个亚型，以往的研究表明M3R参与炎症反应和组织器官纤维化等。本研究应用免疫组织化学和Western blot技术，检测小鼠皮肤切创后损伤区及周边区各时间段M3R的表达情况，探讨M3R在皮肤损伤愈合中的作用及其在损伤时间推断上应用的可能性。
　　 实验材料与方法：
　　 健康成年清洁级昆明小鼠50只，雌雄不限，体重35～40g，随机分为10组。其中9组为皮肤切创组，另一组为正常对照组，每组均为5只小鼠。乙醚气体吸入麻醉，背部剪毛处理后，常规手术消毒，在背部中央做一纵行长1.5cm皮肤全层切口，深达筋膜。分别于伤后0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d和14d将小鼠麻醉后脱颈椎处死，取伤口处1.5㎝x1.0cm皮肤组织；正常对照组小鼠麻醉后背部剪毛，不做切创，观察14d，脱颈椎处死，取相同部位同等大小皮肤。以各HE染色、免疫组织化学染色和Western blot检测应用。应用免疫组织化学和Western blot技术检测50只小鼠皮肤切创后各时间段M3R变化情况。在显微镜x400倍下，于损伤区及损伤周边区随机选取10个视野，计细胞总数、阳性细胞数及阳性细胞率。应用Scion image软件检测各时间段的平均光密度值，测得数据用均数±标准差（x±s）表示。用SPSS13.0 for Windows进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 正常对照组小鼠皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺及皮肌层中均表达M3R。皮肤切创伤后6h，可见少数多形核粒细胞有M3R表达；伤后12～24h，大量的多形核粒细胞和部分单个核细胞M3R呈阳性；伤后1～3d随着时间的延长，M3R阳性细胞主要以单个核细胞为主；伤后5～14d，M3R主要表达在成纤维细胞中。伤后0～6h，M3R阳性细胞率较低，随着伤后时间的延长，M3R阳性细胞率逐渐增加，12h达到高峰，伤后1～5d一直呈高表达状态，伤后7d M3R阳性细胞率再次达到高峰，随后逐渐下降。各时间组与相邻上组的细胞总数及阳性细胞率差异均有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示正常对照皮肤有M3R阳性条带，皮肤切创伤后各时间段组M3R表达强度有一定规律。伤后0～12h，阳性条带逐渐增强，1d，稍有下降，3d、5d，条带变化不明显，7d，M3R.阳性条带再次达到高峰，伤后10d，M3R减弱，到伤后14d，M3R阳性条带基本与正常对照组条带情况一致。除0h与正常对照组之间平均光密度值差异无统计学意义外（P<0.05），其余各组与其相邻上组之间平均光密度值差异均具有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：
　　 1、正常对照组小鼠皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺及皮肌层中均表达M3R。
　　 2、小鼠皮肤切创愈合过程中多形核粒细胞、单个核细胞及成纤维细胞均表达M3R。
　　 3、小鼠皮肤切创愈合过程中M3R表达的规律性变化可用于皮肤损伤时间的推断。

目录

文摘

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前言

实验材料与方法

实验结果(附论文照片)

讨论

结论

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参考文献

综述

参考文献

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