骨髓源性神经干细胞制备的新技术及其临床应用的可行性研究

摘要

干细胞研究为大量难治性神经系统疾病带来了福音。截至2010年10月18日,在美国国立卫生研究院正式登记的干细胞治疗临床试验有3248项,其中基于成人干细胞的治疗方案超过73种疾病,包括1400项FDA批准的临床试验,涉及神经系统疾病包括但不限于:神经系统遗传性疾病、帕金森病、脑瘫、肌萎缩性侧索硬化症和脊髓损伤。而且针对神经系统疾病的干细胞研究不仅限于此,但缺乏理想的种子细胞阻碍了干细胞治疗的发展。探求一种高效、高质、安全的种子细胞是当今干细胞用于治疗特定的神经系统疾病的热点、难点。
　　 目前可用于移植治疗的干细胞主要包括胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞因受伦理学争议和细胞安全性等影响,阻碍了其在临床治疗中的应用;而成体干细胞无论是神经干细胞(neural stem cells,NSCs)、骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、脂肪源性干细胞(adipose tissue-derivedstem cells,ATSCs)、还是脐血源性干细胞(Umbilical Cord Blood StemCells,UBSCs),在体外均具有自我更新及多向分化的潜能,并表现相应的形态、表型和生物学特征。因此成体干细胞及其衍生物移植或动员神经组织内的干细胞被认为是将来治疗难治性神经系统疾病的有效方法。但NSCs在成人的脑细胞中仅占0.001％,且细胞周围有大量的已分化细胞,具有取材不便,手术损伤较大和体外扩增时间长等缺点;UBSCs取材于异体,存在免疫源性和传播疾病的可能;ATSCs和BMSCs均具有自体取材、体外快速培养扩增、致瘤风险低、低免疫源性和免疫调节等特点,但ATSCs取材和培养操作较复杂。因此,BMSCs及其衍生物有望成为临床移植治疗难治性神经系统疾病的种子细胞。然而从初期的试验性治疗发展到成熟的临床应用标准仍存在大量问题,其中包括:1、细胞来源和制备的安全性;2、体内、外诱导生成的细胞是否真正的成神经分化为机体需要的具有特定功能的神经细胞;成神经分化的比例;3、移植后机体内的迁移途径,以及与受体组织的整合度。
　　 目的：
　　 本课题针对上诉问题提出:1、建立无异种异体蛋白的高效高质BMSCs分离培养体系;2、采用尽可能接近人体神经细胞发育的内环境(脑脊液),完成BMSCs成神经分化,生成近似于天然形成的成体神经细胞;3、以大脑中动脉阻断的大鼠为研究对象,观察移植脑脊液诱导的骨髓源性神经干细胞(BMSCs derived neuralstem cells,BMSC-Ns)改善大鼠行为学指标的情况,细胞体内的迁移途径,以及与受体组织的整合度。
　　 以期通过本课题的研究建立无异种异体蛋白成分的临床级移植干细胞制备的培养体系;建立高效高质的BMSC-Ns制备的新技术,获得更为“原生态”的细胞;对获得的BMSC-Ns从生物学特性和移植治疗的有效性两方面进行鉴定,为其应用于临床奠定基础。在获得医院伦理委员会批准的情况下,进一步完成脑脊液诱导的BMSC-Ns临床治疗部分难治性中枢神经系统疾病的疗效观察。
　　 试验包括:不同来源血清或血浆体外培养人骨髓间充质干细胞的研究;自体脑脊液诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为临床用神经样细胞的研究;脑脊液诱导的骨髓源性神经干细胞治疗大鼠大脑中动脉缺血模型的实验研究;脑脊液诱导的骨髓源性神经干细胞临床治疗部分难治性中枢神经系统疾病的疗效观察(附3例报告);
　　 材料和方法：
　　 抽取健康志愿者骨髓60ml,分为3组,A组、B组以:Percoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化人BMSCs,在培养过程中分别加入自体血清和胎牛血清作为营养基质;C组以半骨髓法分离纯化人BMSCs,在培养过程中加入骨髓血浆作为营养基质,观察比较三组细胞形态学特征、神经细胞特异性抗原标志物的表达、传代培养时间及C组在诱导剂作用下成骨和成肝细胞分化的潜能。抽取骨髓30ml,分为2组,分别采用自体脑脊液和细胞生长因子为诱导剂,体外诱导人BMSCs定向分化为神经样细胞,从形态学、免疫组化、荧光免疫组化、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法对诱导后不同时间细胞进行形态学特征、神经细胞特异性抗原标志物表达的鉴定。以大鼠的MCAO模型为研究对象,用Brdu在移植前标记移植细胞。分为3组,A组、B组、C组移植细胞分别为脑脊液诱导的BMSC-Ns、BMSCs和生理盐水。在完成MCAO大鼠模型后1周,侧脑室途径移植到模型鼠脑内,通过改良神经功能缺损评分(改良NSS)、HE染色法脑梗死体积测定、免疫荧光组化染色等方法,观察移植后对脑缺血损伤的影响,以及移植细胞在脑内的存活、迁移、分化情况,探讨不同移植细胞治疗局灶性脑缺血的可能机制,为临床研究及应用打下基础。于2009年9月～2010年9月,应用自体脑脊液诱导的BMSC-Ns治疗部分难治性神经系统疾病(脑瘫患者6例,脑梗塞后遗症患者4例,帕金森病3例,脑出血后遗症2例,脑白质病1例,进行性肌营养不良2例,上升型脊髓炎1例)。从患者骨髓分离出BMSCs,体外经过分离培养后,自体脑脊液诱导3天,制成BMSC-Ns悬液,蛛网膜下腔途径输注患者体内进行疗效观察。
　　 统计分析:采用SPSS12.0统计软件分析,所有参数均用means±SD表示,同组问参数分析利用t检验,不同组间参数比较利用单因素或多因素方差分析,p＜0.05考虑有统计学意义。
　　 结果：
　　 从BMSCs的形态学、细胞表面抗原标志物表达上看各组无明显差异,生长状况良好,C组生成细胞数较A组、B组稍有增加。C组BMSCs在一定的诱导条件下可诱导分化为成骨细胞和肝样细胞。以含自体脑脊液的诱导剂诱导BMSCs,24h细胞形态明显改变,3d胞体回缩,光性增强,回缩球下形成许多突起,渐渐形成锥形、星状、三角形,不规则,类似于树突及轴突样结构和星状胶质细胞,4～5d后星状细胞数目逐渐增多,并可互相形成连接,具有神经样形态结构,仅有少量细胞脱落、死亡。在继续维持下,相互连接交积成网。免疫组化、免疫荧光和RT-PCR结果显示诱导后细胞有表达早期的神经标记物(如β-Tubulin),也有表达成熟神经细胞的标记物(如NF、GFAP)。与细胞因子诱导组相比,从时间上可以大大缩短神经干细胞、神经元的生长周期,细胞长势良好。30ml骨髓分离培养出的BMSCs,经脑脊液诱导后生成的神经样细胞完全可以满足临床4次治疗需要的细胞。脑脊液诱导的BMSC-Ns或BMSCs移植均能使大脑中动脉阻塞(Middle cerebral arteryocclusion,MCAO)大鼠的神经功能学指标明显改善、梗塞面积减少(较对照组p＜0.05),而BMSC-Ns移植效果优于BMSCs移植组;BMSCs或BMSC-Ns移植后梗死侧大脑半球均可见较多BrdU阳性细胞,而对侧半球仅有少量;BMSC-Ns移植细胞在脑组织内存活量明显高于BMSCs移植组;BMSC-Ns移植在脑内表达NSE阳性细胞的阳性率和总数均明显高于BMSCs移植组,对照组仅见少量BrdU阳性细胞。临床选择病例标准,自体脑脊液诱导自体BMSCs生成神经样细胞,蛛网膜下腔注射,治疗部分难治性神经系统疾病,疗效观察,神经功能缺损症状改善。
　　 结论：
　　 1、以骨髓血浆作为BMSCs培养的营养基质,所获得并传代的BMSCs具有较强的自我更新和多向分化能力,较常规分离培养方法获得的细胞数高,且避免了异种异体蛋白带来的免疫排斥和疾病传播等副作用。因此骨髓血浆为理想的营养基质。
　　 2、半骨髓培养法避免了分离液的应用,减少了BMSCs外源性成分的接触环节,安全性提高,且此种培养方法效率较高;
　　 3、脑脊液诱导BMSCs可成功分化为神经样细胞,诱导后早期有的细胞表达了神经元的标记物(如β-TubulinⅢ),也有的表达星形胶质细胞的标记物(如GFAP),随着诱导时间的延长,细胞主要表达成熟神经元的标记物(如NSE、NF),而不表达GFAP。与细胞因子诱导组相比,从时间上可以大大缩短神经干细胞、神经元的生长周期,诱导为神经样细胞的效率较高,细胞长势良好。且脑脊液和骨髓均取自自体,为“原生态细胞”,无免疫排斥反应,理论上更适合于临床的应用。
　　 4、脑脊液诱导的BMSC-Ns移植治疗MCAO大鼠,可以明显改善其行为学指标;移植细胞在体内可以存活,并到达缺血坏死区域,在体内细胞存活量较多,且多以神经元样细胞为主,效果优于直接BMSCs移植组。
　　 5、脑脊液诱导BMSC-Ns蛛网膜下腔移植治疗部分难治性神经系统疾病,效果良好,神经功能缺损的症状改善。