表达Aβ3-10s以缺陷腺病毒为载体的基因疫苗鼻粘膜免疫AD双转基因鼠对老年斑形成的预防作用及对免疫反应的影响

摘要

前言及目的：
　　 阿尔茨海默病(AD)是痴呆中最常见的类型,在AD的多种病理改变中,Aβ缩氨酸成为了重要的治疗目标。近年来的研究发现,β-淀粉样蛋白(Aβ)在AD病情进展中扮演了重要的角色。基因技术的发展为AD的基因治疗提供了理论基础,使免疫治疗AD成为了可能。在AD的主动免疫和被动免疫的基础研究中,免疫治疗可以减少脑内老年斑的沉积,改善认知能力的下降。1999年AN1792疫苗(由人工合成的Aβ1-42和有表面活性的QS-21为佐剂组成)在临床实验中取得了一定的效果,虽然Ⅱ期临床实验中出现了无菌性脑膜炎被迫停止,但是经AN1792免疫过的AD患者在以后多年的观察中未再发现脑膜炎症状,几例尸检发现患者脑内老年斑减少,其他患者在认知能力方面有一定的改善。经研究发现,T细胞介导的细胞免疫反应在Aβ免疫中起到了主要的作用,胶质细胞明显增多,第二代AD疫苗的研究重点在尽量避免细胞免疫,加强体液免疫。研究认为,Aβ1-42的C末端有数个抗原决定簇,可以激活与炎症有关的T细胞反应,N末端含B细胞抗原决定簇,不诱发炎症反应。与疫苗相连的佐剂及载体的选择也成为了人们研究的重点。研究构建一个具有安全性和有效性的Aβ疫苗可以减少老年斑、改善行为学,同时避免疫苗的副作用,增强Th2型免疫反应,抑制Th1型免疫反应,为进一步的临床治疗提供基础,从而减轻AD患者的痛苦。
　　 实验材料和方法：
　　 基于以上的理论基础,我们将人工合成的Aβ3-10的基因片段插入到真核表达质粒pcDNA3.1+,以CpG为基因佐剂,使用E1/E3缺陷的腺病毒载体pAxCAwtit作为基因载体,将目的基因Aβ3-10CpG插入此腺病毒载体,再将腺病毒载体包装入真核细胞,获得基因重组缺陷腺病毒AdCpG-(Aβ3-10)10。通过鼻粘膜免疫双转基因小鼠B6.Cg-Tg(APPswe,PSEN1dE9)。选择Aβ肽链N端的氨基酸序列3-10避免了C端T细胞抗原决定簇的细胞免疫反应,佐剂CpG可以诱导Th2型免疫反应,缺陷的腺病毒载体可以用于粘膜免疫,从而减少肌肉注射带来的痛苦。我们将实验设为三组,含有目的基因的hdCpG-(Aβ3-10)10、不含目的基因的AdCpG组、Aβ1-42全肽链组分别免疫双转基因小鼠,每三周免疫一次,免疫八次,免疫期间采血四次用ELISA方法检测血清IgG抗体,免疫完成后进行Morris水迷宫实验测试小鼠学习记忆能力,潜伏期时间和空间探索试验即平台所在象限时间与总时间比值,然后用免疫组化方法观察脑内老年斑的数量测定OD值,星形胶质细胞的活化,HE染色观察各个脏器有无病理改变,同时用MTT。方法观察脾细胞增值反应,Con A刺激和各自抗原刺激结果,刺激后用ELISA法检测IL-2、IL-4、IL-10及γ-干扰素等细胞因子含量,了解炎性反应类型。
　　 结果：
　　 双转基因小鼠经六个月AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗免疫,进行血清抗体检测,免疫第四次后各组可以检测到抗Aβ42抗体,第六次免疫后hdCpG-(Aβ3-10)10组和Aβ-42组小鼠检测到高浓度的抗Aβ42抗体,AdCpG-(Aβ3-10)10组和Aβ1-42组小鼠血清中检测出抗体浓度较上一次增高(AdCpG-(Aβ3-10)1021.17±1.59ng/ml,Aβ1-4223.93±1.66 ng/ml),与对照组比较有明显差异(P＜0.05),免疫8次后AdCpG-(Aβ3-10)10组和Aβ1-42组小鼠血清中检测出抗体浓度与上一次相近,(AdCpG-(Aβ3-10)1018.95±0.74ng/ml,Aβ1-4221.57±1.31ng/ml),与对照组比较有明显差异(P＜0.05)。免疫组织化学法显示脑内海马区及脑皮质沉积的Aβ老年斑,AdCpG-(Aβ3-10)10组和Aβ1-42组小鼠的脑内各区老年斑减少,Aβ3-10组老年斑的面积占海马区及皮质区总面积的比例是2.58‰;Aβ1-42组老年斑的面积占海马区及皮质区总面积的比例是3.29‰;对照组老年斑的面积占海马区及皮质区总面积的比例是39.37‰。因此AdCpG-(Aβ3-10)10组和Aβ1-42免疫的小鼠Aβ的沉积比对照组明显减少(P＜0.01),AdCpG-(Aβ3-10)10组和Aβ1-42免疫的小鼠之间Aβ的沉积无明显差异(P＞0.05)。HE染色各组小鼠脏器结构正常。十个月时进行Morris水迷宫实验,AdCpG-(Aβ3-10)。。组和Aβ1-42组小鼠逃避潜伏期时间较对照组明显缩短(P＜0.05),空间探索实验AdCpG-(Aβ3-10)。。组和Aβ1-42组小鼠在平台所在象限时间较对照组明显增多(P＜0.05),说明AdCpG-(Aβ3-10)10组和Aβ1-42组小鼠免疫后认知能力得到改善,AdCpG-(Aβ3-10)10组和Aβ1-42组小鼠的潜伏期随着训练时间的增加而逐步减少(P＜0.05),与对照组AdCpG小鼠的潜伏期比较有明显差异(P＜0.05);AdCpG-(Aβ3-10)。。和Aβ1-42组小鼠在撤掉平台后寻找平台过程中穿越平台所在象限的时间占总时间比值(Aβ3-10组10.87±3.27;Aβ1-42组12.45±4.12)较对照组(7.32±4.98)明显增多(P＜0.05)。AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗和Aβ1-42免疫后,脾细胞体外培养,经Con A刺激脾细胞增殖数量增多,与对照组比较有明显差异(P＜0.05),各自抗原刺激后经AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗免疫的脾细胞体外培养,培养液中IL-4(342.34±45.68)和IL-10(329.46±112.99)较高,经Aβ42免疫后的脾细胞增殖分泌的细胞因子IL-2(284.81±22.55),INF-γ(361.96±26.47),IL-4(223.19±22.45)和IL-10(258.68±102.42)均较高,与对照组比较结果有明显差异(P＜0.05)。AdCpG-(Aβ3-10)10组小鼠脑内星形胶质细胞,Aβ1-42组脑内星形胶质细胞活化明显,星形胶质细胞在海马区细胞量明显增多,突起明显增多,呈分枝状。
　　 结论：
　　 我们的研究显示用AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗主动免疫三个月的双转基因鼠B6.Cg-Tg(APPswe,PSEN1dE9),诱导出了高浓度的抗Aβ42血清抗体,抑制了脑内老年斑的生成,改善了转基因鼠的认知功能,证明了疫苗的有效性;对免疫后转基因鼠脾细胞增殖反应及脾细胞培养上清液中的细胞因子进行检测,AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗免疫后的IL-4和IL-10水平明显增高,IL-2和INF-γ含量低;此外脑内星形胶质细胞活化受到抑制,结果说明疫苗主要产生了Th2型体液免疫应答,没有明显的Th1型细胞免疫反应,证明了疫苗的安全性。这些结果对AD疫苗的发展是非常重要的,这个新的AdCpG-(Aβ3-10)10疫苗作为二代AD疫苗为阿尔茨海默病进一步的应用提供了实验和理论依据。