内皮-单核细胞激活多肽II增强血肿瘤屏障通透性的机制

摘要

目的：血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)主要由脑微血管内皮细胞,胶质细胞和周细胞组成,内皮细胞之间有紧密连接(tight junction,TJ),BBB不仅能够保护脑组织,同时还能阻碍治疗性药物进入脑内。而主要由供应肿瘤的毛细血管内皮细胞和胶质瘤细胞所构成的血肿瘤屏障(Blood-tumor Barrier,BTB)也具有限制抗肿瘤药物有效地进入脑内的特点。因此,选择性开放BTB成为治疗脑胶质瘤的重要策略。药物通过血肿瘤屏障一般有两种途径:细胞旁途径和跨细胞途径。我们的前期研究表明内皮-单核细胞激活多肽Ⅱ(Endothelial Monocyte ActivatingPolypeptide-Ⅱ,EMAP-Ⅱ)能够通过细胞旁途径选择性地开放BTB,而不影响正常脑组织,但是,关于EMAP-Ⅱ选择性开放BTB的具体机制尚未见报道,有待进一步研究。
　　 本研究的目的在于明确EMAP-Ⅱ选择性开放BTB的作用位点及其通过细胞旁途径选择性开放BTB的可能机制。
　　 方法：
　　 1、大鼠C6脑胶质瘤模型和体外血肿瘤屏障模型的制备。
　　 2、应用伊文思兰(evans blue,EB)渗透性实验检测给予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗体预处理后脑胶质瘤大鼠BTB通透性的变化。
　　 3、测量体外BTB模型的跨内皮阻抗(transendothelial electric resistance,TEER)值和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)流量,检测给予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗体预处理后体外BTB通透性的变化。
　　 4、应用RT-PCR法检测给予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗体预处理后,在体BTB模型中紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的mRNA表达水平变化。
　　 5、应用Western blot法检测给予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗体预处理后,在体和体外BTB模型中claudin-5、occludin、ZO-1的蛋白质表达水平变化。
　　 6、在体和体外BTB模型中,分别应用免疫组织化学法和免疫荧光法检测给予EMAP-Ⅱ作用1h以及α-ATP合成酶抗体预处理后,claudin-5、occludin、ZO-1的分布和表达水平的变化。
　　 7、在体和体外BTB模型中,应用双重免疫荧光法检测EMAP-Ⅱ和α-ATP合成酶在脑胶质瘤微血管内皮细胞上的分布。
　　 8、在体外BTB模型中,应用蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性实验检测EMAP-Ⅱ作用不同时间点时,总的PKC活性的变化。
　　 9、在体外BTB模型中,应用Western blot法检测EMAP-Ⅱ作用不同时间点时,PKC各亚型(α,β,γ,ε,δ,ζ)的蛋白质表达水平的变化。
　　 10、测量体外BTB的TEER值和HRP流量,检测给予EMAP-Ⅱ作用1h以及PKC或/和RhoA抑制剂预处理后体外BTB通透性的变化。
　　 11、应用免疫荧光法检测给予EMAP-Ⅱ作用1h以及PKC或/和RhoA抑制剂预处理后,体外BTB模型中claudin-5、occludin、ZO-1的分布和表达水平变化。
　　 12、应用Western blot法检测给予EMAP-Ⅱ作用1h以及PKC或/和RhoA抑制剂预处理后,体外BTB模型中claudin-5、occludin、ZO-1的蛋白质表达水平变化。
　　 13、应用Western blot法检测给予EMAP-Ⅱ作用1h以及PKC或/和RhoA抑制剂预处理后,体外BTB模型中肌球蛋白轻链(MLC)及磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)的蛋白质表达水平变化。
　　 结果：
　　 1、成功地建立了大鼠C6脑胶质瘤模型和体外血肿瘤屏障模型。
　　 2、EMAP-Ⅱ作用1h后,大鼠C6脑胶质瘤模型的BTB通透性显著增加;体外BTB模型的TEER值显著降低,HRP流量显著增加。在C6脑胶质瘤大鼠中,α-ATP合酶抗体预处理显著抑制了EMAP-Ⅱ增加BTB通透性的作用;在体外BTB模型中,α-ATP合酶抗体预处理显著抑制了EMAP-Ⅱ增加HRP流量的作用,同时抑制了EMAP-Ⅱ降低TEER值的作用。
　　 3、在体和体外BTB模型中,给予EMAP-Ⅱ作用1h后,脑胶质瘤微血管内皮细胞上claudin-5、occludin、ZO-1的表达显著减少,其分布由连续状念变为不连续状态。α-ATP合成酶抗体预处理使claudin-5、occludin、ZO-1在微血管内皮细胞上呈连续性分布。α-ATP合成酶抗体预处理显著抑制了EMAP-Ⅱ降低BMECs中claudin-5、occludin、ZO-1表达的作用。
　　 4、在体和体外BTB模型中,EMAP-Ⅱ和α-ATP合酶在脑胶质瘤微血管内皮细胞膜上共定位。
　　 5、在体外BTB模型中,BMECs中总PKC活性于EMAP-Ⅱ作用1h时显著增强,随后逐渐减弱,4h恢复到未用药时水平。
　　 6、在体外BTB模型中,EMAP-Ⅱ作用1h时BMECs中PKC-α,β,ζ的蛋白表达水平显著增高,随后逐渐减弱,4h恢复到未用药水平。而PKC-γ,ε,δ的蛋白表达水平无明显变化。
　　 7、在体外BTB模型中,PKC抑制剂H7和RhoA抑制剂C3 exoenzyme单独及联合应用,显著抑制了EMAP-Ⅱ增加BTB通透性的作用。
　　 8、在体外BTB模型中,PKC抑制剂H7和RhoA抑制剂C3 exoenzyme单独及联合应用,使claudin-5、occludin、ZO-1在BMECs上呈连续性分布;同时显著抑制了EMAP-Ⅱ降低claudin-5、occludin和ZO-1蛋白表达的作用。
　　 9、在体外BTB模型中,EMAP-Ⅱ作用1h显著增加p-MLC的蛋白表达水平,而MLC的蛋白表达水平未受影响。PKC抑制剂H7和RhoA抑制剂C3exoenzyme单独及联合应用,显著抑制了EMAP-Ⅱ增加p-MLC蛋白表达的作用。
　　 讨论：EMAP-Ⅱ是一种肿瘤起源的前炎症因子,具有促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成的作用。我们近期的在体研究证明EMAP-Ⅱ能通过细胞旁途径增加BTB的通透性,却并不影响正常BBB的通透性。我们本次的在体及体外研究结果均显示:EMAP-Ⅱ作用1h后,BTB的通透性显著增加,TJ相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表达显著降低,有力地支持了我们的前期在体研究结果,即EMAP-Ⅱ能够通过开放TJ的细胞旁途径增加BTB的通透性。
　　 为了确定EMAP-Ⅱ选择性开放BTB的作用位点,我们在应用α-ATP合成酶抗体预处理后,检测脑胶质瘤组织微血管内皮细胞上claudin-5、occludin、ZO-1的分布和表达变化。结果显示给予α-ATP合成酶抗体预处理后,EMAP-Ⅱ的上述作用受到显著抑制。同时,双重免疫荧光结果证实了EMAP-Ⅱ与α-ATP合成酶在肿瘤组织微血管内皮细胞表面共定位。以上实验结果提示脑胶质瘤组织微血管内皮细胞膜上的α-ATP合成酶是EMAP-Ⅱ选择性丌放血肿瘤屏障的可能作用位点。体外研究结果还显示:EMAP-Ⅱ作用1h时,微血管内皮细胞的总PKC活性最佳,PKC亚型(α,β,ζ)的蛋白表达水平显著增加。给予PKC或RhoA抑制剂预处理后,EMAP-Ⅱ所致BTB通透性增加、claudin-5、occludin、ZO-1表达减少的作用受到显著地抑制,当同时给予PKC及RhoA抑制剂预处理后,EMAP-Ⅱ的上述作用几乎完全被抑制,说明PKC和RhoA信号分子在EMAP-Ⅱ所介导的BTB通透性增高过程中发挥着至关重要的作用。
　　 结论：
　　 1、在大鼠C6脑胶质瘤模型和体外BTB模型中,EMAP-Ⅱ能通过降低TJ相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的细胞旁途径选择性地增加BTB的通透性。
　　 2、特异性α-ATP合酶抗体预处理显著抑制了EMAP-Ⅱ增加BTB通透性的作用,以及EMAP-Ⅱ降低BMECs中claudin-5、occludin、ZO-1表达的作用。
　　 3、脑胶质瘤微血管内皮细胞膜上的α-ATP合成酶是EMAP-Ⅱ选择性增加BTB通透性的作用位点。
　　 4、PKCα、PKCβ和PKCζ在EMAP-Ⅱ发挥其选择性增加BTB通透性作用的过程中表达上调,PKCδ,PKCε和PKγ),的表达未见变化,提示,PKCα、PKCβ和PKCζ是EMAP-Ⅱ增加BTB通透性过程中的重要信号分子。
　　 5、RhoA-pMLC信号通路参与调控EMAP-Ⅱ增加BTB通透性的过程。
　　 6、PKC抑制剂H7和RhoA抑制剂C3 exoenzyme单独及联合应用,显著的抑制了EMAP-Ⅱ增加BTB通透性、降低claudin-5、occludin和ZO-1蛋白表达以及增加p-MLC蛋白表达的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词

论文一 内皮-单核细胞激活多肽Ⅱ通过脑微血管内皮细胞膜上的α-ATP合成酶增强血肿瘤屏障的通透性

前言

在体实验部分

材料与方法

结果

体外实验部分

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 信号分子PKC和RhoA在内皮-单核细胞激活多肽Ⅱ增强血肿瘤屏障通透性中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 选择性开放血肿瘤屏障的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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