盐酸多奈哌齐对沙鼠短暂性脑缺血再灌注损伤的神经元保护机制研究

摘要

前言：
　　 脑缺血即脑的短暂性血液供应不足，是一种急性的神经损伤，是人类三大死亡原因之一。血管性痴呆(vascular dementia, VD)是由各种脑血管疾病导致的获得性、持续性认知障碍综合征。目前认为，大脑反复缺血再灌注是造成VD的主要原因之一。脑缺血可造成海马CA1区迟发性神经元坏死，从而导致学习记忆及空间定向等一系列行为障碍。沙鼠双侧颈动脉闭塞全脑脑缺血模型与人类的颈动脉闭塞很相似，是研究人类脑缺血的理想动物模型。
　　 盐酸多奈哌齐是第二代治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)的胆碱酯酶抑制剂，具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制作用，能够增加动物大脑乙酰胆碱含量，具有改善学习记忆障碍、选择性强、作用时间长、无肝脏毒性等特点，其抑制作用是可逆的、非竞争性的，通过抑制AchE，能够使直接参与神经传递的突触间隙的Ach含量增加，是应用于AD的轻、中度对症治疗药。越来越多的证据表明，血管性痴呆患者有着与AD患者类似的胆碱能物质缺乏，因而胆碱能药物（胆碱前体和胆碱酯酶抑制剂）也逐渐用于VD临床治疗，以改善血管性痴呆患者的认知功能。
　　 本研究通过Morris水迷宫实验比较各组沙鼠的学习记忆能力，以及比较Ca2＋-CaMK-CREB信号转导通路中p-CaMKⅡ和p-CREB磷酸化蛋白水平的变化和海马CA1区锥体细胞数的变化，为阐明盐酸多奈哌齐对沙鼠脑缺血保护机制提供理论依据。
　　 材料与方法：
　　 1、动物、试剂与仪器
　　 雄性沙鼠，Bradford法测定蛋白浓度试剂盒（普利莱基因技术有限公司），彩色预染蛋白质分子量标准（碧云天生物技术公司），DYY-5型稳流稳压电泳仪电泳仪（北京六一仪器），Hoefer miniVE垂直电泳，低温高速离心机（Centrifuge5810R,德国Eppendorf），苏木素染液和伊红染液（南京建成生物工程研究所），LeicaCM1900冰冻切片机，OLYMPUS BX51等。
　　 2、沙鼠脑缺血模型制备及给药
　　 36只雄沙鼠随机分为假手术组、缺血组、缺血治疗组，每组各12只，乙醚麻醉，颈部正中切口，分离两侧颈总动脉，无创伤微血管夹夹闭双侧颈总动脉，阻断血流10min后再灌注，消毒，缝合创口，放回原条件下饲养。假手术组除不夹闭颈总动脉外，其余操作同上。缺血治疗组从手术后当天连续灌胃给药(5mg/kg/d)三周，假手术组、缺血组从手术后当天连续灌胃给相同体积的生理盐水三周。
　　 3、神经学评价
　　 手术24h后观察各组沙鼠的神经症状，按五个等级评分：0，无症状；1，背部弓起；2，强直性癫痫发作；3，上睑下垂；4，无意识。评价后分值越高，神经损伤越严重。
　　 4、Morris水迷宫实验测试各组沙鼠的学习记忆能力
　　 Morris水迷宫行为学测试各组沙鼠的学习记忆能力，训练四天后，记录其每天的平均逃避潜伏期（四天）和最后一天的90s内的穿台次数。
　　 5、HE染色观察各组沙鼠的海马CA1区
　　 HE染色观察各组沙鼠的脑内海马CA1区病理变化。
　　 6、Western blotting方法检测p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白表达
　　 提取各组沙鼠脑海马组织中p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白，考马斯亮蓝法蛋白定量，经10％SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转印至PVDF膜上，一、二抗孵育，ECL化学发光法显色。
　　 7、统计学分析
　　 结合图像采集分析系统，所得数据用均数±标准差表示，应用SPSS11.0统计软件，除水迷宫的潜伏期数据用重复测量数据的方差分析，其他数据用单因素方差分析进行组间比较，P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01为有显著统计学意义。
　　 实验结果：
　　 1、神经学评价结果显示缺血组和缺血治疗组的分值明显高于假手术组（P＜0.01），而缺血组与缺血治疗组无差异（P＞0.05）。
　　 2、Morris水迷宫结果显示缺血组每天的平均潜伏期较假手术组的延长(P＜0.01)，而缺血组与缺血治疗组之间比较无差异（P＞0.05）。最后一天的穿台实验结果显示缺血组穿台次数明显少于假手术组(P＜0.05)，缺血治疗组的穿台次数明显多于缺血组，而缺血治疗组与假手术组无差异（P＞0.05）。
　　 3、HE染色结果显示假手术组海马CA1区锥体细胞排列整齐紧密，缺血组失去正常结构，锥体细胞层次极其紊乱有空泡样变，锥体细胞减少，缺血治疗组锥体细胞排列较紧密，未见空泡样变，锥体细胞较缺血组有所增加（P＜0.05）。
　　 4、Western blotting结果显示缺血组沙鼠脑海马组织中p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白的表达较假手术组和治疗组减少（P＜0.05），而假手术组与缺血治疗组比较无差异（P＞0.05）。
　　 结论：
　　 1、沙鼠脑缺血再灌注24h后能引起神经损伤，而盐酸多奈哌齐不能快速改善神经损伤。
　　 2、沙鼠脑缺血组海马组织中的p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白水平的表达较假手术组减少。
　　 3、缺血治疗组海马组织中的p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白水平的表达较缺血组增加。
　　 4、盐酸多奈哌齐改善沙鼠脑缺血再灌注引起的学习记忆障碍，其机制可能是通过增加海马组织中的p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白水平的表达，从而启动多种保护基因的表达（C-fos，BDNF，Bcl-2等），使海马CA1区神经元得到保护，进而改善学习记忆障碍。

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论文 盐酸多奈哌齐对沙鼠短暂性脑缺血再灌注损伤的神经元保护机制研究

前言

材料与方法

实验结果

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结论

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参考文献

综述 治疗阿尔茨海默症的药物研究进展

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