新生大鼠心房肌细胞Kir3.1基因siRNA的筛选与鉴定的实验研究

摘要

目的:
　　 心动过缓是临床上最常见的心律失常之一，人群发病率高，是威胁人类健康和长寿的常见心血管病之一。其发生机制与迷走神经系统活性密切相关。心脏迷走神经通过释放乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)作用于心房毒蕈样2受体-G蛋白-乙酰胆碱敏感性钾电流通道，激活乙酰胆碱敏感性钾通道（Acetylcholine-sensitive muscarinic K+channel，KACh）使钾离子外流增加。进而使动作电位4位相最大复极电压绝对值增大，使心肌细胞自律性降低，导致心动过缓的发生。KACh道由Kir3.1/Kir3.4基因共同编码的蛋白亚基组成。研究表明：该通道的功能主要与Kir3.1基因有关。本实验应用特异性小RNA干扰(Smallinterference RNA，siRNA)抑制新生SD大鼠心房肌细胞Kir3.1基因表达；以筛选出干扰效率最高的siRNA，并应用分子生物学方法进行鉴定，为今后将RNA干扰技术引入心动过缓机制的研究及基因治疗心动过缓提供新思路。
　　 方法:
　　 体外人工合成3对针对Kir3.1基因的siRNA寡核苷酸片段，分别转染至心房肌细胞。应用荧光定量聚合酶链反应( Real-time Polylneras Chain reaction，Real-timePCR)方法筛选出抑制率最高的siRNA，并将其转染至原代培养的新生SD大鼠心房肌细胞，收集空白组细胞以及转染后24h，48h，72h，96h的细胞，分别利用Real-time PCR、蛋白免疫印记(Westem blot)检测Kir3.1 mRNA和蛋白质的表达。
　　 结果:
　　 (1)酶消化法培养的大鼠心房肌细胞纯度和活力均高，72h后体外培养的新生鼠心房肌细胞生长密度可达瓶底70％，并出现细胞簇的同步搏动，免疫荧光法检测心肌细胞纯度达90％以上；(2)人工合成的siRNA转染新生鼠心房肌细胞对Kir3.1基因的抑制率最高可达（39.9±0.3）％；(3)新生鼠心房肌细胞转染对Kir3.1基因抑制率最高的一组siRNA，其KACh的表达在mRNA水平和蛋白水平均降低，并呈现时间依赖性。24h时Kir3.1mRNA表达量开始下降，为对照组的(56±1)％;48，72h时下降更为明显，分别为对照组的(49±3)％及(33±1)％(P＜0.05)，至96h时，为对照组的(88±4)％，抑制效果不显著（P＞0.05）。(4)Western blot检测发现，48及72h后转染组Kir3.1蛋白水平较对照组明显下降，分别是对照组的(37±3)％和(19±2)％（P＜0.01）。
　　 结论:
　　 体外合成针对Kir3.1基因的siRNA在mRNA和蛋白水平均可降低KACh的表达。说明在体外培养的新生大鼠心房肌细胞进行RNA干扰Kir3.1基因表达可行，并具有潜在的治疗效应。但人工合成的小片段siRNA进入细胞后容易被降解，72h后其抑制目标mRNA的作用已不显著。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

论文 新生大鼠心房肌细胞Kir3.1基因siRNA的筛选与鉴定的实验研究

前言

材料与方法

头验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 细胞移植心脏生物起搏器的研究进展

参考文献

在学期间科研成绩

致谢

个人简介