选择性五羟色胺再摄取抑制剂对星形胶质细胞cPLA2a表达和5-HT2B受体RNA编辑的影响

摘要

前言：抑郁症是一种常见的心理障碍,不仅发病率和致死率高,还给病人家庭及社会造成了沉重的经济负担。选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)是目前治疗抑郁症的常用药物,对于其药理作用机制,传统的观点认为是抑制突触5-HT的再摄取而增加突触内该递质的浓度,从而增强5-HT信号传导。然而这一观点却很难解释选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)很快增加抑郁症患者大脑突触间隙的5-HT浓度,却需数周后才能改善患者临床症状的现象。这表明选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)的药物作用机制除了增加细胞外5-HT浓度外,可能还有别的靶点。
　　 星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的一种细胞,其体积占大脑的20-50％。星形胶质细胞对神经元起着支持和营养等作用,此外有研究表明它还参与脑的代谢,同时跟神经元也有广泛的联系。随着对星形胶质细胞功能研究的深入,越来越多的证据表明它在抑郁症的发病过程中发挥着重要作用,而且可能是抗抑郁药物作用的新靶点。
　　 cPLA2是一种钙离子依赖性胞浆型磷脂酶,它能水解细胞膜磷脂中sn-2位点的酰酯键,产生溶血磷脂和游离脂肪酸(例如花生四烯酸)。花生四烯酸的释放和代谢对大脑的可塑性和信号传导起着重要的作用。cPLA2a亚型是cPLA2在星形胶质细胞中的主要表达类型。我们最近发现氟西汀是星形胶质细胞5-HT2B受体的特异性激动剂,氟西汀慢性作用星形胶质细胞可引起cPLA2a表达的升高,并且该上调作用需要经5-HT2B受体介导的EGFR间接激活途径参与。如果氟西汀对星形胶质细胞5-HT2B受体的激动作用在其治疗抑郁症的过程中发挥作用的话,那么其他四种传统的五羟色胺再摄取抑制剂,帕罗西汀,舍曲林,氟伏沙明,西酞普兰,其治疗浓度药物慢性作用于星形胶质细胞时,对5-HT2B受体和cPLA2a的作用可能跟氟西汀一致。
　　 RNA编辑(RNA editing),是转录后的RNA前体经过修饰和加工使RNA所携带的遗传信息发生改变的过程。RNA编辑的发生主要是通过作用于RNA的腺苷酸脱氨酶(ADARs)对RNA碱基水解脱氨而进行,其中腺苷(A)到肌苷(I)的转变(adenosine-inosine)是编辑的主要形式。腺苷(A)经过编辑后变成了肌苷(I),而肌苷(I)在翻译的过程中被误认为是鸟苷(G),这样就引起遗传信息的改变,最终导致相应编码蛋白结构和功能发生改变。ADARs有三个亚型,即ADAR1、ADAR2和ADAR3。5-HT2C受体是至今发现的唯一一个存在RNA编辑现象的G蛋白偶联受体,且编辑后受体功能下调。5-HT2B受体同5-HT2C受体都属于5-HT2受体家属,其基因序列有高度的相似性,存在发生RNA编辑的可能,而我们最近发现氟西汀处理3天的星形胶质细胞5-HT2B受体mRNA表达升高,但其功能却下调了,这进一步提示我们5-HT2B受体可能存在RNA编辑现象。
　　 本课题主要在原代培养的星形胶质细胞中,研究选择性五羟色胺再摄抑制剂(SSRIs)对星形胶质细胞的作用及机制。即:①分析比较五种选择性五羟色胺再摄抑制剂(SSRIs)对星形胶质细胞cPLA2a表达的调节作用;②研究该作用是否需要激活5-HT2B受体;③选择性五羟色胺再摄抑制剂(SSRIs)氟西汀慢性作用星形胶质细胞对5-HT2B受体和ADARs表达的调节作用;④氟西汀对星形胶质细胞5-HT2B受体RNA编辑的调节作用。
　　 方法：
　　 采用原代培养的小鼠大脑星形胶质细胞。①分别用选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)帕罗西汀,舍曲林、氟伏沙明、西酞普兰处理细胞1-4周,用RT-PCR和免疫印迹方法检测药物对cPLA2a亚型的作用;②用帕罗西汀,并加入SB204741(5-HT2B受体抑制剂)或AG1478(EGF受体酪氨酸激酶抑制剂)或GM6001(Zn2+介导的金属蛋白酶抑制剂)处理星形胶质细胞,然后用免疫印迹方法检测cPLA2a的表达。③10μM氟西汀处理星形胶质细胞3天,然后用RT-PCR和免疫印迹方法检测5-HT2B受体和ADARs的表达。④10μM氟西汀处理星形胶质细胞3天,用AMRS-PCR检测5-HT2B受体潜在位点的RNA编辑。
　　 使用SPSS12.0软件进行统计学分析,多组资料用one-way ANOVA方法进行比较,P＜0.05表示差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)对星形胶质细胞cPLA2a表达的上调作用。1μM的帕罗西汀、氟伏沙明、舍曲林慢性作用可以上调星形胶质细胞cPLA2a的表达,而西酞普兰在0.1-0.5μM即可引起相同效果,这些药物浓度跟药物的治疗浓度相近。
　　 2、帕罗西汀引起星形胶质细胞cPLA2a表达的升高需要由5-HT2B受体介导,并需激活Zn2+依赖性金属蛋白酶,EGF受体。5-HT2B受体抑制剂(SB204741)、EGF受体酪氨酸激酶抑制剂(AG1478)、金属蛋白酶抑制剂(GM6001)和ERK1/2磷酸化抑制剂(U0126)均抑制了帕罗西汀对星形胶质细胞cPLA2a表达的上调作用。
　　 3、氟西汀慢性作用可引起星形胶质细胞5-HT2B受体和ADAR2表达的升高,但其ERK1/2磷酸化水平下降。
　　 在对照组(生理盐水处理细胞三天),10μM氟西汀处理细胞20分钟,其ERK1/2磷酸化水平显著增加,但是实验组细胞经1μM或10μM氟西汀作用3天后,再用10μM氟西汀急性作用细胞20分钟,ERK1/2磷酸化不变。此外,10μM氟西汀处理3天的星形胶质细胞,其5-HT2B受体和ADAR2表达升高。
　　 4、氟西汀慢性作用可引起星形胶质细胞5-HT2B受体RNA编辑,并且该作用需要ADAR2的参与。
　　 原代培养的星形胶质细胞的5-HT2B受体有8个位点存在RNA编辑现象,10μM氟西汀处理星形胶质细胞3天后,有五个位点编辑的比例升高,而用RNA干扰技术下调ADAR2表达后,氟西汀对编辑位点的调节作用被阻断。
　　 讨论：
　　 1、选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)对星形胶质细胞cPLA2a的调节作用在正常成熟的中枢神经系统中,胶质细胞不表达五羟色胺转载体(SERT),本实验中原代培养的星形胶质细胞也不表达SERT,这表明SSRIs药物对星形胶质细胞的作用不可能通过作用于SERT。原代培养的星形胶质细胞经dBcAMP处理分化成熟后,大量表达5-HT2B受体,并且Ditte Lovatt等利用流式细胞仪(FACS)技术从小鼠脑内分离的星形胶质细胞也表达5-HT2B受体。现在的关键问题是治疗剂量的选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)是否通过激活脑内5-HT2B受体而发挥抗抑郁作用?功能失调性态度是评估抑郁症情绪的一项指标,其值的高低能评价抑郁的严重程度。Meryer等通过观察发现5-HT2B受体的激动剂氟苯丙胺降低了健康个体的功能失调性态度,这表明药物对5-HT2B受体的激活同抗抑郁作用密切相关。我们将SSRIs治疗剂量的血药浓度跟引起星形胶质细胞cPLA2a表达变化的作用浓度进行了比较,推测在长期应用SSRIs类药物治疗时,星形胶质细胞的5-HT2B受体可能是药物的一个作用靶点。
　　 大鼠经氟西汀长期作用后,脑内cPLA2a表达升高。cPLA2a激活后,膜磷脂sn-2位置特异性释放花生四烯酸。花生四烯酸释放增多是抑郁症患者应用SSRIs治疗后的一个已知的生物学作用。花生四烯酸能够大大的增强星形胶质细胞内的葡萄糖代谢和糖原分解。星形胶质细胞的葡萄糖代谢占整个脑的30％。花生四烯酸对星形胶质细胞的葡萄糖代谢的影响在抑郁症的病理生理和药理治疗学中均有重要作用。抑郁症病人脑的多个区域的葡萄糖代谢均有下降,特别是在额颞部位,抑郁症的严重程度跟脑内葡萄糖代谢的减退程度密切相关。抗抑郁药选择性五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)能够使减退的葡糖糖代谢回复正常。
　　 2、氟西汀对星形胶质细胞5-HT2B受体RNA编辑的调节作用本研究发现星形胶质细胞的5-HT2B受体存在RNA编辑现象,氟西汀慢性作用可以上调位点发生编辑的程度,并且该作用需要ADAR2的参与。5-HT2B受体和5-HT2C受体同属于G蛋白偶联受体。在G蛋白偶联受体家属中,过往研究只发现5-HT2C受体存在RNA编辑,而我们首次证明了5-HT2B受体也存在RNA编辑现象。先前我们报道了氟西汀慢性作用星形胶质细胞5-HT2B受体可能跟其治疗抑郁症的药理机制相关,并且在以往对5-HT2C受体研究的过程中发现抑郁症患者脑内5-HT2C受体mRNA的各编辑位点的编辑百分比较正常者有变化,而且这种变化经过持续抗抑郁药治疗后可能会恢复到原水平。因此我们推测星形胶质细胞5-HT2B受体的RNA编辑在抑郁症的病理过程中可能发挥着重要角色,而氟西汀对5-HT2B受体RNA编辑的调节作用可能是其抗抑郁药理机制的重要组成部分。实验中发现原代培养的星形胶质细胞ADAR2表达较多,而ADAR1很少,氟西汀慢性作用可以上调ADAR2的表达而对ADAR1没有作用;此外,我们应用RNA干扰技术下调ADAR2的表达后,氟西汀对5-HT2B受体RNA编辑的调节作用即被阻断,这些结果均表明氟西汀对5-HT2B受体RNA编辑的调节作用可能是通过ADAR2介导的。
　　 本课题所研究的星形胶质细胞都是原代培养的,而不是直接来自在体。不过,我们在培养细胞的过程中加入了dBcAMP(双丁酰环腺苷酸)来替代在体的去甲肾上腺能信号系统,达到促进细胞分化成熟,从而使培养的细胞跟体内的星形胶质细胞相似。
　　 结论：
　　 1、在原代培养的小鼠大脑星形胶质细胞中,五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)帕罗西汀、氟伏沙明、舍曲林和西酞普兰对cPLA2a表达的慢性调节作用跟氟西汀相似,1μM帕罗西汀、氟伏沙明、舍曲林即上调cPLA2a的表达;而西酞普兰在0.1-0.5μM即可引起相同效果,这些药物浓度跟药物的治疗浓度相近。
　　 2、在原代培养的小鼠大脑星形胶质细胞中,5-HT2B受体存在RNA编辑现象,并且氟西汀慢性作用可上调5-HT2B受体RNA编辑的程度,该作用需要ADAR2的参与。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

前言

论文一、选择性五羟色胺再摄取抑制剂对星形胶质细胞cPLA2a表达的调节作用

研究目的

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二、氟西汀对星形胶质细胞5-HT2a受体的调节机制——RNA编辑

研究目的

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究的创新性自我评价

参考文献

综述:5-HT2C受体和谷氨酸受体的RNA编辑现象

在学期间科研成绩

致谢

个人简介