凝集素芯片鉴别胸水中的癌细胞与反应性间皮细胞的临床应用价值

摘要

目的：
　　 胸腔积液是肺部多种疾病的常见并发症,它也是验证疾病病因,判断其良恶性的重要媒介。大约20％的胸腔积液是由恶性肿瘤引起,其中的50％又为原发性肺癌。约30％的肺癌患者最初的临床表现是胸腔积液,而细胞病理学是诊断恶性胸腔积液的标准方法。肺癌病灶浸破脏层胸膜,常引起胸腔积液,癌细胞可同时或随后脱入胸腔内,形成胸腔脱落癌细胞。一旦误诊,发展为胸膜转移多在短期内死亡。
　　 细胞病理学诊断恶性胸腔积液有一定的困难,通常其阳性率仅有50-60％,尤其恶性胸腔积液内含有大量的反应性间皮细胞时难度更大。当恶性胸腔积液中含有少量异型性不明显的腺癌细胞,同时又存在大量的反应性间皮细胞时,诊断这样的积液非常具有挑战。传统的方法,例如免疫细胞化学和酶联免疫吸附试验,在胸腔积液的鉴别诊断中提供着较大的帮助。迄今为止,为了提高细胞学的诊断率,许多具有细胞特异性抗原的肿瘤标记物已经被应用于胸腔积液的诊断,然而最准确的肿瘤标记物仍然有待于被发现。
　　 糖基化是翻译后修饰的主要形式之一,并且糖基化的水平随着细胞分化和细胞恶性转变的不同而不同。这就表明细胞的种类和不同的分化阶段具有潜在的不同的标记物。特定的细胞种类例如胚胎干细胞具有特异表面糖基化类型。近来有文献证明不同的聚糖信号分子的激活可能导致了不同的细胞生物学过程。聚糖结构的组合数要远远大于DNA和蛋白质结构的数量。细胞表面大量不同的聚糖结构与细胞和外界环境,相邻细胞及病原体之间的关系紧密相关。
　　 本课题以肺癌为主攻对象,以肺癌患者的胸腔积液为检测基础,应用凝集素芯片检测恶性胸腔积液中的腺癌细胞及良性胸腔积液中的问皮细胞的细胞膜表面的差异,同时评估凝集素芯片区分恶性胸腔积液和良性胸腔积液的能力,以提高细胞学的诊断效能。
　　 材料与方法：
　　 收集中国医科大学附属第一医院2010年2月至2010年8月门诊及住院患者胸腔积液108例,其中:恶性胸腔积液54例(肺腺癌),以及良性胸腔积液54例(肺炎患者32例,肺结核患者22例)。
　　 1、凝集素芯片的制备；
　　 为了将凝集素芯片固定到载玻片上,我们选择3-氨丙基三甲氧基硅烷作为耦合剂来处理载玻片。凝集素被溶解为1 mg/mL(SNA,MAL-Ⅰ and MAL-Ⅱ)或0.5mg/mL(其它凝集素),然后用芯片点样仪MicroGridⅡ(BioRobiotics,England)将凝集素点到处理后的载玻片上,完毕后,将新制作的凝集素芯片放在湿度＞80％,温度25℃的室内孵育24小时。
　　 2、凝集素芯片对A549细胞系及胸腔积液中腺癌细胞及间皮细胞的检测；
　　 应用凝集素芯片对肺腺癌细胞系(A549),胸腔积液中腺癌细胞及间皮细胞细胞膜表面的糖链表达情况进行检测,获得这些细胞细胞膜表面的糖链表达谱。垂悬在PBS中的细胞室温下在凝集素芯片上孵育30分钟,孵育后用PBS除去未结合或过量的细胞。靠PBS重力作用轻柔的将未结合或过量的细胞从凝集素芯片上去除。结合后的凝集素芯片进行巴氏染色并且由两名细胞病理学医师进行观察。所有的过程都是在盲法下进行的。
　　 结果：
　　 1、应用凝集素芯片获得A549细胞表面的聚糖谱；
　　 凝集素芯片捕获A549细胞,结果显示A549仅表达AAL,MAL-I,WGA,STL,Jacalin,ACA位点,而其它位点不捕获A549细胞。这个结果表明A549细胞表面拥有自己独特的聚糖结构并且这些聚糖结构可以被凝集素芯片所捕获。
　　 2、应用凝集素芯片获得胸腔积液中腺癌细胞表面的聚糖谱；
　　 为了证明凝集素芯片能够区分胸腔积液中的腺癌细胞与间皮细胞,我们检测了临床上54例胸腔积液中的腺癌细胞。54例肺癌患者胸水中的腺癌细胞除了与A549细胞表达AAL,MAL-I,WGA,STL,Jacalin和ACA位点一样外,还表达了ECA,DSA位点,然而其它位点未捕获到细胞,54例患者8个位点的表达率也有不同,其中AAL,WGA,和ACA位点的捕获率较高,分别是54,48和38例,然而ECA,DSA位点的捕获率较低,分别为4,4例。
　　 3、应用凝集素芯片获得胸腔积液中反应性间皮细胞表面的聚糖谱；
　　 通过凝集素芯片,54例胸腔积液中反应性间皮细胞的聚糖表达图产生。除了BSA位点未捕获细胞外,54例间皮细胞在25个凝集素位点上均有表达,但表达率不同,SNA,AAL位点在这25个位点中的表达率较高,分别捕获了50,48例。然而DBA,MAL-Ⅱ和EEA位点的捕获率较低,分别为2,4和4例。
　　 4、生物标记物的发现；
　　 为了检验凝集素芯片发现生物标记物的能力,我们比较了间皮及腺癌细胞表面的聚糖发现,SNA位点有着明显的不同,在54例患者中捕获间皮细胞50例而腺癌细胞捕获0例。这预示着SNA凝集素可能能用来区分腺癌细胞和间皮细胞。
　　 讨论：
　　 胸腔积液中鉴别反应性间皮细胞和腺癌细胞是诊断学上的挑战,胸膜转移性腺癌与间皮细胞增生具有一定的相似性,所以导致了诊断的困难。当间皮细胞的异型性小或腺癌细胞的数量较少时,诊断会更加困难。细胞学诊断腺癌细胞假阴性结果有严重的后果,假阴性错误主要是由于腺癌细胞误诊为问皮细胞。假阳性错误主要是由于将间皮细胞误诊为腺癌细胞。糖生物学一直认为不同的细胞种类和阶段的糖基化特征明显不同。最近,Rosenfeld等发明了一种新颖的包含24种凝集素的芯片,这种凝集素具有高通量的特点并且可以检测游离的聚糖,荧光标记的细胞可以通过荧光扫描仪扫描,每个点阵上的荧光信号减去背景的信号来计算。然而,用荧光扫描仪仅仅获得每个点阵的强度,而不是细胞的种类,也就是说我们不能确定它是间皮细胞还是腺癌细胞。
　　 我们采用了一种不通过荧光标记的凝集素芯片,探索凝集素芯片检测细胞表面聚糖的能力,同时获得了腺癌细胞与间皮细胞表面的聚糖表达谱,因此,我们不仅通过显微镜下得到了凝集素结合的细胞种类,而且可以检测到细胞的数量甚至仅仅只是一个细胞,这种方法比荧光扫描仪更敏感正确率更高。在这项研究中,我们发现间皮细胞表面的聚糖种类可能要比腺癌细胞表面的聚糖种类要多,然而在AAL,MAL-I,WGA,STL,Jacalin,ACA,ECA,ConA和DSA位点捕获腺癌细胞的数量要比间皮细胞的数量多。这个结果可能表明腺癌细胞表面的聚糖种类要比间皮细胞多,但是聚糖结构的数量要比间皮细胞多。凝集素芯片捕获A549细胞,结果显示A549仅表达AAL,MAI-I,WGA,STL,Jacalin,ACA位点,而其它位点不捕获A549细胞。54例肺癌患者胸腔积液中的腺癌细胞除了与A549细胞表达AAL,MAL-I,WGA,STL,Jacalin and ACA位点一样外,还表达了ECA,DSA位点,然而其它位点未捕获到细胞,54例患者8个位点的表达率也有不同,其中AAL,WGA,和ACA位点的捕获率较高,分别是54,48和38例,然而ECA,DSA位点的捕获率较低,为4,4例。通过凝集素芯片,54例胸腔积液中反应性间皮细胞的聚糖表达图产生。除了BSA位点未捕获细胞外,54例间皮细胞在25个凝集素位点上均有表达,但表达率不同,SNA,AAL位点在这25个位点中的表达率较高,分别捕获了50,48例。然而DBA,MAL-II和EEA位点的捕获率较低,分别为2,4和4例。因此,我们不但高通量的检测了胸腔积液中的腺癌细胞和间皮细胞,而且还发现了凝集素芯片潜在的临床意义,包括区分腺癌细胞与间皮细胞的能力以及筛选胸腔积液肿瘤标记物的应用价值。
　　 高通量分析的目标是为了发现具有诊断价值的新颖的肿瘤标记物。在前期的研究中我们发现了特异的肿瘤标记物来区分腺癌细胞与问皮细胞。然而间皮细胞的标记物较少,例女HBME-1和D2-40,而且后者诊断效能欠佳。本研究中,SNA位点在54例间皮细胞中表达50例,但是在54例腺癌细胞中表达0例,而且它的敏感性为100％,特异性为92.6％,正确率为96.3％。这表明SNA可能为-新颖的标记物来区分胸腔积液中的腺癌细胞和间皮细胞。
　　 总之,此结果说明了凝集素芯片在区分良性胸腔积液和恶性胸腔积液细胞表面标记物的应用中具有巨大的潜力,并且可能会应用于胸腔积液中区分腺癌细胞与反应性间皮细胞。
　　 结论：
　　 1、胸腔积液中腺癌细胞和反应性间皮细胞表面的聚糖结构具有明显的差异性
　　 2、SNA可以作为一种鉴别胸腔积液中反应性间皮细胞与腺癌细胞的标记物
　　 3、应用凝集素芯片鉴别良性胸腔积液中的反应性间皮细胞和恶性胸腔积液中的腺癌细胞,对肺癌的诊断具有重要的临床应用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述:凝集素芯片的应用及新进展

致谢

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