ATP敏感性钾通道(KATP)开放剂对氧糖剥夺SH-SY5Y细胞凋亡及对AIF信号通路的影响

摘要

目的：
　　 观察KATP通道开放剂对氧糖剥夺诱导SH-SY5Y细胞凋亡影响,并进一步探讨KATP通道开放剂对抗氧糖剥夺诱导SH-SY5Y细胞凋亡的信号转导机制,明确KATP通道开放剂是通过AIF信号转导通路来抑制凋亡,为KATP通道开放剂能尽早应用于临床治疗缺血性脑血管病提供理论依据。
　　 实验方法：
　　 取传代后3d的SH-SY5Y细胞,分为A组(正常对照组)、B组(氧糖剥夺组)、C组(二氮嗪处理组)、D组(二氮嗪+5-羟葵酸-5-HD处理组)共4组。,采用MTT方法检测细胞活力,选取氧糖剥夺最佳时间点及二氮嗪最佳药物浓度,采用Heochst33342/PI双染流式细胞分析仪检测凋亡率,应用免疫荧光染色和Western-blotting检测AIF蛋白表达水平,应用RT-PCR检测AIFmRNA表达水平,观察KATP开放剂对氧糖剥夺诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用。
　　 实验结果：
　　 1.MTT实验结果:二氮嗪可提高氧糖剥夺后细胞性活力的最佳浓度选择。首先,我们分别在各个二氮嗪药物浓度范围(1umol/1,10umol/l,100umol/l,200umol/1,500umol/l)内测细胞活力,二氮嗪浓度在低于200umol/l情况下对细胞没有细胞毒性(figurelA),500umol/l二氮嗪有一定的细胞毒性,细胞活力会降低(P＜0.01)。其次,通过MTT分光光度值我们可以看出,与正常对照组细胞相比,氧糖剥夺后细胞活力明显降低了(P＜0.01),100,200umol/l的二氮嗪处理以后细胞活力明显升高(P＜0.01)(Figure1 B)。200umol/1的二氮嗪升高细胞活力更明显,但是5-HD可以抵抗这一保护作用,在OGD组及二氮嗪+5-HD组无明显差异(P＞0.05),以后的试验中选择200umol/l的二氮嗪作为最佳浓度。
　　 2.SH-SY5Y细胞凋亡结果:正常对照组细胞凋亡率为(7％±2.79％)。氧糖剥夺组细胞凋亡率为(42％±2.65％),二氮嗪处理组细胞凋亡率为(21％±3.10％)。即氧糖剥夺及二氮嗪预处理组细胞凋亡率增加,氧糖剥夺及二氮嗪预处理组与正常对照组比较均有显著性差异(P＜0.01),二氮嗪预处理组凋亡明显比氧糖剥夺组减少,比较有统计学意义(P＜0.01)。而5-HD可以拮抗二氮嗪这一保护作用,氧糖剥夺组和二氮嗪+5-HD处理组无显著性差异(P＞0.05)。
　　 3.蛋白免疫印迹结果:A、B、C和D组AIF蛋白含量比较无差异(P＞0.05)。说明了AIF总的蛋白含量没有发生变化,有可能亚细胞器发生了变化。
　　 4.半定量RT-PCR结果:A、B、C和D组AIFmRNA含量比较无差异(P＞0.05)。说明了AIF的mRNA总含量没有发生变化,有可能亚细胞器发生了变化。
　　 5.免疫荧光结果:二氮嗪可以减少氧糖剥夺导致的AIF细胞核转移。在正常对照组,用免疫荧光图像可以观察到AIF(红色)在胞浆和胞核都有表达,但以胞浆为主(A)。氧糖剥夺导致细胞凋亡后AIF(红色)在胞浆和胞核都有表达,但以胞核为主,AIF发生了细胞核转移(B)。在二氮嗪组AIF(红色)在胞浆和胞核都有表达,但以胞浆为主(C)。但是5-羟葵酸可拮抗二氮嗪的保护作用,在B组和D组没有差别。细胞核使用Heochst33342蓝色的标记.Scale bar=100mm。
　　 结论：
　　 KATP通道开放剂二氮嗪能明显增加氧糖剥夺后SH-SY5Y细胞活力,降低氧糖剥夺后SH-SYSY细胞凋亡,对细胞AIF总蛋白及mRNA表达没有改变,但是可以减少氧糖剥夺诱导的AIF发生的细胞核转移,提示KATP通道开放剂可能通过激活AIF途径来减少氧糖剥夺后SH-SY5Y细胞凋亡。

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结果

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结论

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参考文献

综述:凋亡诱导因子与脑缺血神经元凋亡

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