人类肛门直肠正常胚胎发育及CDX1/TCF4与先天性肛门直肠畸形发生关系的研究

摘要

前言：先天性肛门直肠畸形(anorectal malformations,ARM)是小儿外科最常见的先天性消化道畸形,其发病率约为1/5000～1/1500。由于ARM是复杂的多基因疾病,由环境因素和遗传因素共同作用所致,迄今为止,ARM的发病机制仍不清楚。近年来,虽然ARM的诊疗水平有一定提高,但仍有近30％的患儿术后出现不同程度的并发症:排便、排尿及性功能障碍,严重影响患者生活质量,给患儿、家庭和社会带来沉重的负担。因此,阐明ARM的发病机制对于探索新的治疗方法、采取有效预防措施具有极其重要的意义。
　　 尽管近年来国内外学者应用人类胚胎和致畸的动物模型标本对肛门直肠正常和异常的发育过程进行了初步研究,认为肛门直肠畸形的发生是胚胎期直肠发育发生障碍的结果,但是至今仍没有完全阐明人类正常肛门直肠胚胎发育的演变规律,对ARM胚胎发病机制更是知之甚少。胚胎期肛门直肠的形态演变和构型改变依赖于细胞定向分化、增殖及细胞凋亡的协同作用,前人研究显示,在小鼠肛门直肠的胚胎发育过程中,细胞增殖/凋亡在泄殖腔分离、肛膜及尿生殖膜崩解中发挥了重要的作用。然而在人类肛门直肠的胚胎发育过程中,细胞增殖/凋亡是否参与其中,发挥了何种作用尚未得到明确。
　　 揭示ARM的发病机制关键在于明确ARM的基因调控和胚胎发生机制,普遍认为ARM是一组受多因素影响的,涉及多个基因的复杂畸形。目前国内外对ARM的实验研究多采用乙烯硫脲、维甲酸等致畸建立ARM动物模型,观察其胚胎发生的病理改变和基因表达规律及模式。有研究显示,Cdx1是调控胚胎尾端发育的重要基因之一,胚胎早期表达于尾端的间质和粘膜,生后主要表达于粘膜,调控粘膜上皮细胞的分化和增殖。此外,在Tcf4基因敲除小鼠表现出严重的肛门直肠畸形,如:后肠缺如、尾端发育不良等,上述研究提示Cdx1、Tcf4在肛门直肠的胚胎发育过程中起重要作用。然而在ARM胚胎发育过程中,Cdx1、Tcf4表达模式是否存在异常,表达模式的变化是否与ARM的出现存在关联,二者如何调控消化道末端发育,这些问题均未得到满意的解决。
　　 ARM发病机制和病理改变十分复杂,多伴发其他畸形,其遗传方式和外显率尚不清楚,涉及的相关基因繁多,至今尚未对ARM相关基因定位。人类ARM基因候选基因的研究尚处于起步阶段,尤其尚无明确的有义基因突变的报道,因此从分子水平探索人类ARM的发病机制具有十分重要的意义。
　　 本研究应用3至9周人胚标本,通过H&E染色后连续动态观察肛门直肠的形态变化过程并结合TUNEL及PCNA免疫组织化学染色分析细胞增殖/凋亡的时空分布规律,揭示肛门直肠的胚胎发育过程,初步探讨的细胞增殖/凋亡在肛门直肠胚胎发育中的作用。同时,本研究应用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸的Wistar大鼠的ARM动物模型,分析Cdx1及Tcf4蛋白和mRNA在正常及ARM大鼠胚胎肛门直肠的时空分布规律,探讨Cdx1及Tcf4在大鼠胚胎肛门直肠发育过程中所发挥的作用;研究Cdx1及Tcf4与ARM胚胎发生机制的关系。此外,我们采用基因测序的方法筛查CDX1基因外显子的突变,应用生物信息学技术分析突变位点可能引起的功能改变,并结合应用免疫组织化学、定量PCR和蛋白印记研究CDX1在人类ARM的直肠末端的表达,目的在于初步探讨CDX1与ARM发病之间的关系。
　　 材料和方法：
　　 一、实验材料
　　 (一)人类胚胎标本收集因意外妊娠进行人工流产,发育正常的人类胚胎标本108例(每例标本均取得产妇本人同意)。根据产妇末次月经时间、Carnegie stages人胚胎形态发育特征和超声所测胎儿头臀长、双顶径等确定胎龄为3～9周。
　　 (二)临床组织标本收集我院2006～2009年手术的ARM患儿直肠末端标本25例,男14例,女11例,平均年龄4.5个月,其中高位畸形7例,低位畸形18例。对照组由12例死于非胃肠道疾病患儿的直肠末端标本,男5例,女7例,平均年龄1.5个月。取直肠末端后壁组织,放入经DEPC处理后的无菌EP管中,立即置于液氮中速冻后置于-80℃冰箱中保存。
　　 (三)血样标本无血缘关系的中国北方汉族健康个体120名,其中男60名,女60名,平均年龄3.53岁,经询问病史及体格检查,排除先天性畸形。无血缘关系的中国北方汉族ARM患者,男62例,女46例,平均年龄2.02岁,样本来自2003年至2009年中国医科大学附属盛京医院小儿外科,经手术确诊,均符合ARM诊断标准。
　　 (四)实验动物Wistar大鼠(体重250～300g),由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。
　　 (五)实验试剂:
　　 ①TUNEL购自德国罗氏公司；
　　 ②PCNA、CDX1、TCF4多克隆抗体(购自美国Santa Cruz公司)；
　　 ③免疫组化UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒(购自福州迈新生物技术开发有限公司)；二步法山羊免疫组化检测试剂盒(购自北京中杉金桥公司)；
　　 ④乙烯硫脲(Ethylenethiourea,ETU)(购自德国Sigma-Aldrich公司)；
　　 ⑤逆转录试剂盒(购自大连宝生物工程有限公司)；
　　 ⑥总蛋白抽提试剂盒(购自凯基公司)；
　　 ⑦TaqDNA聚合酶及其反应缓冲液(TaKaRa公司)；
　　 ⑧实时定量PCR试剂盒(购自TaKaRa公司)。
　　 二、实验方法
　　 (一)人类后肠及肛门直肠胚胎发育的研究3-5周胚胎取整个胚胎,5-9周胚胎取其盆部,标本经0.01M PBS液冲洗后立即置于4％多聚甲醛中固定12小时～24小时,常规脱水,石蜡包埋。石蜡标本进行矢状面连续切片,厚度4μm,在显微镜下观察未染色切片,在观察到泄殖腔或直肠膀胱出现时连续保留切片,连续的3张切片分别进行H&E、TUNEL和PCNA的免疫组化染色。
　　 (二)Cdx1/Tcf4在肛门直肠畸形大鼠胚胎发育中时空性表达的研究在成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天(GD10),按125mg/kg经胃管给予孕鼠ETU(浓度为1％,以生理盐水做溶剂),制作ARM大鼠动物模型;对照组给予等量的生理盐水。分别在大鼠GD13-GD21时剖宫取胎,部分取完整胚胎或胚胎盆部,经4％多聚甲醛固定、脱水后制成蜡块,行矢状面或横断面的连续切片,进行Cdx1/Tcf4的免疫组化染色连续动态对比观察Cdx1/Tcf4在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠发育过程中的表达。常规制备胎鼠冰冻切片,解剖显微镜下手工显微切割方法准确切取泄殖腔标本,从中提取总RNA和总蛋白,通过RT-PCR与Western blot方法研究Cdx1、Tcf4 mRNA和蛋白在正常以及畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠的表达。所有数据均以x-±s表示,差异比较采用SPSS13.0统计软件进行各胎龄正常组与ARM组t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　 (三)CDX1基因与人类ARM关系的研究采用EDTA抗凝外周静脉全血2ml,用苯酚-氯仿法提取全基因组DNA,进行CDX1基因外显子PCR扩增,PCR产物进行测序分析。人类正常及ARM直肠末端标本进行CDX1的免疫组化、Western blot及定量PCR实验,对其表达进行定位和定量,并比较分析。
　　 结果：
　　 一、人类后肠及肛门直肠胚胎发育的研究
　　 (1)第3周时,可以在尾端背侧区观察到边界清晰的泄殖腔结构,由泄殖腔膜将其与羊膜腔分隔。第4-6周时,随着胚胎尾端向背侧伸展和旋转,尿直肠隔进一步向泄殖腔内延伸、突出,其尖端与泄殖腔膜距离逐渐缩小,但未观察到尿直肠隔与背侧泄殖腔膜的融合。泄殖腔膜由垂直位转型呈水平位生长,背侧泄殖腔膜逐渐变薄。第7周时,肛膜破裂,肛门直肠与外界相通,肛门直肠区的上皮的差异性开始出现,尿直肠隔转向腹侧和头侧生长,其尖端与腹侧泄殖腔膜距离逐渐缩小,可以观察到二者之间仍存在潜在的狭窄腔隙。第8周时,尿直肠隔进一步向腹侧生长,尿直肠隔与泄殖腔膜的内胚层上皮发生融合,之前裂隙消失,生殖结节的间质深入腹侧泄殖腔膜之中,继续延展参与尿道的组成。
　　 (2)第6周,凋亡细胞主要位于肛门直肠、尿直肠隔及尿生殖窦的上皮;尤其是在肛门开口区周围分布着大量凋亡细胞;第7周,凋亡细胞大量分布于直肠末端和直肠背侧间质区;第8周,直肠及肛管上皮中可以见到凋亡细胞,而在尿直肠隔背侧与泄殖腔膜内仅观察到少量的凋亡细胞。
　　 (3)第6周,肛门直肠、尿生殖窦及尿直肠隔上可以观察到微弱的增殖细胞;散在的增殖细胞位于背侧泄殖腔膜;第7周,尿直肠隔间质中可见增殖细胞出现,这些细胞大部分位于肛门直肠和尿直肠隔腹侧的间质内;第8周,增殖细胞主要分布于尿道和肛门直肠的上皮中,同时在尿直肠隔与腹侧泄殖腔膜的和融合区域内有大量增殖细胞聚集。
　　 二、Cdx1/Tcf4肛门直肠畸形大鼠胚胎发育中时空性表达的研究Cdx1/Tcf4在大鼠发育过程中正常胚胎泄殖腔中表达,在13天和14天主要表达于尿直肠隔和泄殖腔膜,胚胎15天时在尿直肠隔与泄殖腔膜融合处Cdx1/Tcf4表达较强,16天时肛膜破裂,肛门直肠与外界相通,Cdx1/Tcf4在直肠粘膜层表达。Cdx1/Tcf4在ARM胎鼠泄殖腔和直肠粘膜层表达较弱或呈现阴性表达。Westernblot和RT-PCR半定量检测结果:在发育期的后肠中Cdx1/Tcf4和Cdx1/Tcf4 mRNA的表达表现出时间依赖性的特点:在肛门形成的关键时期Cdx1/Tcf4的表达水平达到高峰,一旦肛门形成其表达量随即开始降低,畸形组与正常组相比较,Cdx1/Tcf4蛋白(Cdx1蛋白半定量分析结果156.9±23.5 vs.102.7±14.4(14天),165.5±26.2 vs.104.5±14.6(14.5天),153.6±19.4 vs.76.2±10.7(15天));(Tcf4蛋白半定量分析结果71.25±3.2 vs48.21±2.8(14天),70.86±2.9 vs47.85±2.3(14.5天),71.02±2.7 vs46.21±3.6(15天))。Cdx1/Tcf4 mRNA的表达在14～15d明显降低,(Cdx1mRNA半定量分析结果0.52±0.08 vs.0.38±0.04(14天),0.49±0.06 vs.0.37±0.08(15天));(Tcf4 mRNA半定量分析结果0.48±0.08 vs0.37±0.05(14天),0.49±0.08 vs0.39±0.04(14.5天),0.47±0.05 vs0.36±0.03(15天)),有统计学差异(P＜0.05)。
　　 三、CDX1基因及其表达产物与人类ARM关系的研究
　　 (一)通过对108例ARM个体进行CDX1基因外显子测序,在编码区共发现4个个体携带4种不同的CDX1突变位点(5.5％,4/108),包括1例直肠会阴瘘,1例直肠前庭瘘,1例直肠尿道瘘,1例肛门狭窄。上述突变位点CDX1的高度保守的同源结构域中,2例发生于CDX1第3外显子的DNA结合区(c.6G＞C,K199N;c.27G＞T,R206S);1例位于特异性DNA结合区(c.18A＞C,Q203H);另外一个位于第1外显子(c.213-214Ins GAA,97-98insE)。
　　 (二)在应用免疫荧光化学法检测TCF4/CDX1的表达研究中,畸形组患儿与对照组直肠末端组织粘膜层CDX1、TCF4表达较强,而在畸形组中CDX1、TCF4表达明显减弱。
　　 (三)ARM末端肠壁CDX1 mRNA相对表达量,高位组(98.67±8.3)和低位组(156.89±10.23)均明显低于正常对照组(263.81±8.92)(P＜0.0001)。不同畸形之间,高位组和低位组之间差异存在统计学意义(P＜0.0001)。
　　 (四)Western蛋白印迹结果显示,ARM高位组(0.936±0.085)低位组(1.365±0.15)蛋白表达水平均明显低于正常对照组(1.782±0.067)(P＜0.0001)。不同畸形之间,高位组明显低于低位组(P＜0.0001)。
　　 结论：
　　 1、在人类胚胎发育过程中,尿直肠隔与背侧泄殖腔膜并未发生融合,背侧泄殖腔膜和背侧泄殖腔在肛门直肠发育过程中发挥了重要作用;肛门开口后,尿直肠隔继续向头腹侧移位,与腹侧泄殖腔膜融合,腹侧泄殖腔膜在泌尿生殖道和会阴的胚胎发育中具有重要的意义。
　　 2、细胞凋亡促进了肛门的崩解,使得肛门直肠与羊膜腔相通,在人类肛门直肠的胚胎发育过程中有重要的意义;胎龄第6-8周尿直肠隔,腹侧泄殖腔膜发生的细胞增殖和凋亡促进了尿直肠隔的头腹侧移位,在尿直肠隔与腹侧泄殖腔膜融合过程中发挥了重要的作用。
　　 3、大鼠胚胎肛门直肠的发育过程中,Cdx1/Tcf4可能发挥了重要的作用。
　　 4、ETU致畸的大鼠胚胎ARM肛门直肠发育过程中Cdx1/Tcf4的表达存在着时间-空间不均衡性的特点。ETU致畸的大鼠胚胎期泄殖腔/后肠Cdx1/Tcf4表达模式的改变可能引起ARM的发生,Cdx1/Ycf4表达下调可能与ARM的发生有关。
　　 5、ARM患者中存在CDX1外显子的突变,CDX1表达产物在肛门直肠畸形直肠末端表达下调,CDX1可能是ARM的易感基因,CDX1在人类ARM的发生中可能具有重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词

论文一 人类后肠及肛门直肠胚胎发育的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 Cdx1/Tcf4在肛门直肠畸形大鼠胚胎发育中时空性表达的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 CDX1基因与人类先天性肛门直肠畸形关系的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 细胞调亡与常见消化道畸形关系的研究进展

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