5-FU诱导大鼠气管上皮细胞损伤修复过程中Oct3/4消长分子机制解析

摘要

目的:
　　 目前关于气管干细胞的存在基本上有两种观点：一种是慢性标记细胞(LRC)理论。Borchwick通过连续在雄鼠气管内滴注聚多卡醇或SO2吸入法使气管上皮受损，同期隔日腹膜内注射BrdU，95天后在小鼠气管腺导管内发现了慢性标记细胞，标记指数为30％。尽管该观点被许多杂志引用，但由于不能确定小鼠气管上皮细胞的寿命，故观察95天后的细胞终究为经过几次分裂后的子细胞尚属未知。且所占比例30％过高，其中必定混有短暂增殖组细胞。2007年Kiel等在Nature杂志发表论文，否定了通过慢性标记细胞判定干细胞的可靠性，表明Brdu作为造血干细胞的标记其特异性和敏感性均很低。另一种观点认为基底细胞是干细胞。但这一观点并不符合干细胞的概念。其一干细胞必须是未分化细胞，基底细胞有大量的细胞器，能表达P63及角蛋白5和14。其二数量上不符，肝干细胞仅占肝细胞的0.003，造血干细胞仅占造血细胞的0.001，基底细胞的比例占到30％左右，不可能有如此多的干细胞。再来宋楠等证明稳态下基底细胞不表达提示未分化的Oct3/4基因，但由于其能再建假复层纤毛柱状上皮，因此认为基底细胞为组细胞，而不是干细胞。
　　 而我们实验室认为，Oct3/4，Sox2，Nanog也是气管干细胞的标记物，即Oct3/4，Nanog及Sox2阳性的细胞为气管干细胞。我研究室曾用5-FU作用大鼠气管上皮制备上皮损伤、修复模型，因5-FU抗嘧啶类代谢药，可以使处于增殖的细胞变性坏死，基底膜上仅残存G0期细胞。撤除5-FU后气管上皮经扁平细胞、立方细胞，直至48小时恢复到假复层纤毛柱状上皮。因基底膜无破坏，因此上皮的恢复只能来源于G0期细胞，证明气管干细胞存在于对5-FU抗性G0期细胞中，这些细胞Oct3/4，Nanog及Sox2阳性。证明在5FU诱发大鼠气管上皮损伤、修复过程中，胚胎干细胞相关基因：Oct3/4，Nanog及Sox2出现有规律的表达消失。
　　 Oct3/4出现的这种消长规律，即5Fu作用前未出现，作用后出现，分化时又消失，前一阶段证明与Oct3/4，Nanog及Sox2的启动子DNA甲基化有关，即Oct3/4，Nanog及Sox2在正常的组织中均存在甲基化，5-FU作用后出现了去甲基化，而48h又恢复正常的甲基化水平。表明气管干细胞增殖分化受DNA甲基化调控。那么Oct3/4消长规律与组蛋白修饰（乙酰化，甲基化，泛素化等）有着怎样的关系，目前尚不清楚。本文探讨5-FU诱导大鼠气管上皮细胞损伤修复过程中，组蛋白修饰及相关蛋白与内源性Oct3/4消长的关系及其分子机制。
　　 材料和方法:
　　 1、离体大鼠气管损伤修复模型的制备
　　 取约200克左右的Wistar大鼠，雌雄不限，水合氯醛麻醉，无菌条件下取出气管，PBS冲洗，置于DMEM／F12培养液中（含10％胎牛血清）。取正常气管，剪取一气管环固定，留做石蜡切片，灌入蛋白酶XⅣ(0.5mg/ml)，结扎另一端，4℃消化过夜，收集消化液，加FBS至终浓度为2.5％终止酶反应收集正常气管上皮细胞于2mlEppendorf管中，-70℃冻存，留做mRNA提取。其余气管组织5-FU作用12小时后，置于DMEM／F12培养液中（含10％胎牛血清），分别于换液后0、3、6、12、24、48小时取出气管组织分别固定，留做石蜡切片。
　　 2、免疫组织化学染色
　　 石蜡切片脱蜡至水，高温高压抗原修复，非免疫动物血清封闭，一抗为兔抗HDAC1，4℃孵育过夜；二抗37℃孵育30mins。DAB显色。显微镜下观察并照相。阴性对照实验：用等量的O.O1mol/L PBS代替一抗。
　　 3、Western Blot蛋白印迹
　　 按蛋白抽提试剂盒说明抽提气管上皮细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳，50V恒压湿转120mins，BSA室温封闭2hrs，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育2hrs，DAB显色。转膜后各步之间均用洗膜液洗膜3次，每次5mins。相同条件下用β-actin作为内对照。
　　 4、间接免疫荧光检测气管上皮H3K9ac，H3K4me2，HMGA2、SUMO、NUMB的表达
　　 石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，非免疫动物血清封闭，一抗分别为兔抗H3K9ac，H3K4me2，HMGA2、SUMO、NUMB;二抗分别TRITC标记羊抗兔IgG和FITC标记羊抗兔IgG。DAPI复染细胞核。50％缓冲甘油封片。阴性对照实验：用等量的0.O1mol/LPBS代替一抗，其余步骤同前。
　　 5、统计分析
　　 各组资料利用SPSS for Window13.0进行统计分析。P＜O.05有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、免疫组化检测5-FU诱导损伤修复过程中HDAC1的表达变化正常气管上皮几乎没有HDAC1的表达，去除5-FU作用后Oh，HDAC1少量表达，随后表达量逐渐增高，至24h达到峰值。
　　 2、5-FU诱导损伤修复过程中HDAC1的表达变化蛋白印迹检测大鼠气管上皮损伤修复过程中HDAC1的蛋白水平发现，正常气管上皮没有HDAC1的表达。5-FU打击后出现HDAC1的表达，并随着气管上皮的修复逐渐增加。
　　 3、间接免疫荧光检测5-FU作用后大鼠气管上皮H3K9ac，H3K4me2的表达5-FU作用后出现阳性表达，6小时达高峰，恢复12-24小时基本不表达。
　　 4、间接免疫荧光检测5-FU作用后大鼠气管上皮HMGA2、SUMO、Numb的表达正常气管上皮几乎没有HMGA2、SUMO、NUMB的表达；5-FU打击后6h出现HMGA2，SUMO高表达；恢复48小时Numb表达达到高峰，SUMO为阳性表达，而HMGA2无阳性表达。
　　 结论:
　　 1、在5-FU作用下气管上皮发生重编程，组蛋白修饰及染色质重塑调控内源性Oct3/4表达消长。
　　 2、HDAC1使组蛋白去乙酰化，使染色质致密卷曲，Oct3/4转录受到抑制，为分化的分子开关。
　　 3、HMGA2在未分化和干细胞高表达，可能是代表未分化状态的一个指标。Numb可能与干细胞分化有关。
　　 4、5-FU诱导气管上皮再编程过程及细胞分化过程中，均受表观遗传修饰调控。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

论文 5-FU诱导大鼠气管上皮细胞损伤修复过程中Oct3/4消长的分子机制解析

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 组蛋白修饰及其在肝细胞中的研究进展

参考文献

在学期间科研成绩

致谢

个人简介