P190蛋白胞外disc结构域的体外表达纯化及其互作蛋白的筛选鉴定

摘要

P190蛋白是一种单次跨膜糖蛋白，由1384个氨基酸组成，分子量约为190KD。P190大多表达于脊椎动物脑内，主要存在于中枢及外周神经的有髓神经纤维郎飞结结旁区的轴膜上，其在卵巢、胰脏、肠、肺、心脏及睾丸等组织内也有少量表达。对P190氨基酸序列的分析表明，P190胞外的区域较长（共计1264个氨基酸），含有1个FactorⅧ/discoidin(disc)结构域，2个重复的表皮生长因子结构域，4个层粘连蛋白G结构域，1个纤维蛋白原类似结构域，以及1个脯氨酸-甘氨酸-酪氨酸重复序列结构域；P190蛋白的细胞内区域很短（共计80个氨基酸），含有band4.1蛋白的结合结构域及富含脯氨酸的结构域。研究表明，P190的主要功能是与contactin蛋白形成复合物，富集在神经细胞轴突结旁区细胞膜上，与NF155等结合，在朗飞结的两侧形成一系列胞质环。此连接区能使髓鞘锚定于轴突，从而有助于髓鞘的绝缘和神经冲动的有效传递。有研究显示，小鼠中若缺乏P190可引起结旁轴突与胶质细胞相互作用的丧失及神经传导速度的减慢；P190的异常表达可产生严重的神经系统功能紊乱，P190敲除小鼠不仅神经冲动传导速度明显低于野生型小鼠，而且在出生后不久就会因神经元变性坏死而死亡。另有文献报道，P190表达降低可导致神经纤维脱髓鞘病变，加速轴突的变性坏死。
　　 本实验室首次在人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelialcells，HBMEC)中检测到了P190蛋白的表达，进一步的研究结果提示P190可能作为受体参与调控HBMEC紧密连接的装配，但其涉及的机制尚不清楚。因此，为了进一步探讨P190在HBMEC中的功能及其涉及的机制，本研究利用原核表达体系，对P190胞外段的disc结构域进行了体外表达及纯化；并利用酵母双杂交技术，在人胎脑cDNA文库中筛选能够与P190胞外段的disc结构域发生相互作用的蛋白并进行进一步验证，以期为P190的功能研究及其涉及的分子机制积累科学资料。
　　 方法：
　　 1、PCR扩增P190胞外段disc结构域编码基因，利用重组DNA技术构建原核表达载体；
　　 2、将原核表达重组质粒转化至大肠杆菌BL21，以IPTG进行诱导表达，并对诱导表达条件进行优化，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化；
　　 3、以P190胞外段disc结构域作为诱饵蛋白，利用重组DNA技术构建酵母质粒pGBKT7-P190disc，转化入AH109酵母细胞，利用酵母双杂交技术在人胎脑cDNA文库中筛选与P190disc结构域相互作用的蛋白；
　　 4、分析酵母双杂交的结果，选择感兴趣的目的蛋白，进一步验证P190胞外段disc结构域与该目的蛋白的相互作用。
　　 结果：
　　 1、获得了P190disc结构域的编码基因，构建了用于原核表达的重组质粒pGEX-4T-3-P190disc;
　　 2、在大肠杆菌BL21中诱导表达了GST融合的P190disc蛋白，并利用亲和层析方法纯化得到了GST融合的P190disc蛋白；
　　 3、利用酵母双杂交方法在人胎脑cDNA文库中筛选出14个与P190disc结构域结合的阳性克隆；
　　 4、选择CD24作为目的蛋白，在酵母体内证实了P190disc结构域与CD24的相互作用；
　　 5、以293T细胞作为模式细胞，利用免疫荧光共定位技术发现CD24与P190disc结构域有明显的共定位；
　　 6、RT-PCR方法证实CD24在HBMEC中有表达。
　　 结论：
　　 1、体外表达并纯化得到了P190胞外段disc结构域融合蛋白；
　　 2、利用酵母双杂交实验筛选到了能够与P190胞外段disc结构域相互作用的候选蛋白──CD24，并初步验证了二者的相互作用；
　　 3、首次发现CD24在HBMEC中的表达。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

论文 P190蛋白胞外disc结构域的体外表达纯化及其互作蛋白的筛选鉴定

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

四、本研究创新性的自我评价

五、参考文献

综述 结旁跨膜蛋白P190结构和功能概述

参考文献

在学期间科研成绩

致谢

个人简介