Raf-1蛋白表达及其Ser259磷酸化在非小细胞肺癌中的意义

摘要

目的：
　　 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,肺癌的发病率和死亡率已跃居各类恶性肿瘤的首位,而非小细胞肺癌约占肺癌总数的75.80%,目前肺癌的治疗主要是以手术治疗为主,化学治疗,放射治疗,基因治疗等手段为辅的多学科综合治疗,值得注意的是,确诊时大约有三分之一的病人已经是晚期而限制了疾病治疗方案的选择。
　　 Raf-1是由Raf基因编码的蛋白产物,是Raf家族成员中迄今被研究最多的一个,其表达广泛。Raf-1激酶在信号网络中作为交联节点,Raf-1直接或间接的接受众多细胞外传入信号,如:整合素受体、生长因子受体等的传入信号,其功能区域表达产生的损伤对有丝分裂的刺激与通过膜联合转化原癌基因一样。许多肿瘤中可见其高表达,如肺癌细胞系、肝癌、前列腺癌、原始神经外胚层肿瘤,粒细胞性白血病和头颈部鳞状细胞癌等。Raf-1是一个经典的通路Ras-Raf-MEK-MAPK/ERK信号通路的重要组成部分,该通路将信号由细胞外经胞质传递至细胞核内,介导c-fun、c-fos、c-myc和c-Jun等原癌基因激活,参与细胞存活、增殖与分化等多种生物学反应,进而产生异常分化、异常增殖甚至癌变。
　　 Raf-1的Ser259及Ser621位点磷酸化可通过结合14-3-3蛋白抑制Raf-1催化活性。PKA介导的其Ser-43位磷酸化抑制了Raf-1与ras的结合,从而抑制通路活性。有研究表明,检测Raf-1的Ser259位点磷酸化水平可以一定程度上推测Raf-1的被抑制率。
　　 故本实验拟采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法和蛋白印迹试验(westemblot)检测肺癌组织标本,观察在癌组织与癌旁组织中,Raf-1的表达及其ser259位磷酸化水平的差异及其意义。
　　 材料和方法：
　　 1、材料
　　 随机抽取2010年至2011年期间中国医科大学附属第四医院胸外科手术切除的非小细胞肺癌标本和癌旁组织标本37例,肺癌标本与癌旁组织标本一一对应,均经组织学证实。
　　 2、主要试剂及来源
　　 PCR剂盒(M3001)购自Promega公司,Raf-1引物(自行设计)购自订购于上海生工生物技术有限公司,冻干型兔抗人Raf1抗体(bs-1703R)购自北京博奥森生物技术有限公司,浓缩型兔抗人p-Raf-1(Ser259)抗体(sc-21833R)购自SANTACRUZ公司,兔抗人β-Actin抗体(bs-0061R)购自北京博奥森生物技术有限公司,羊抗兔IgG(H+L)辣根过氧化物酶(bs-0295G)购自北京博奥森生物技术有限公司。
　　 3、方法
　　 (1)RT-PCR:检测Raf-1在21例肺癌组织及对应癌旁组织中mRNA的表达,切取标本经匀浆、离心、加入氯仿、离心、加入异丙醇、离心、75%乙醇、离心、干燥提取mRNA,逆转录,PCR,电泳,紫外扫描。结果判定紫外条件下胶面出现白色条带,目标条带位于516bp,内参条带位于224bp,收集图像并测量灰度。
　　 (2)Westernblot:检测Raf-1及p-Raf-1(Ser259)在37例肺癌组织和癌旁组织中的表达。取新鲜样品0.5克加入0.5ml裂解液,剪碎、匀浆超声处理,高速低温离心提取上清蛋白,电泳,转印,经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂,结果判定PVDF膜上对应分子量位置出现黑色条带,收集图像并测量条带灰度值。
　　 4、数据处理
　　 应用SPSS17.0统计软件进行数据处理:对Raf-1及p-Raf-1(Ser259)的表达的相关性采用配对样本t检验及秩和检验,P＜0.05为有统计学意义。同时以计数资料制四格表行卡方检验,P＜0.05为有统计学意义,以讨论蛋白表达差异与性别、年龄、吸烟与否、淋巴转移与否是否存在相关性。
　　 结果：
　　 1、非小细胞肺癌的癌组织中Raf-1的mRNA表达水平与癌旁组织相比较呈明显上调(p＜0.05)。
　　 2、非小细胞肺癌的癌组织中Raf-1蛋白的表达及其Ser259磷酸化水平与癌旁组织相比较呈明显上调(p＜0.05)。
　　 3、Raf-1与p-Raf-1(ser259)在癌组织相对癌旁组织中变化比率无明显差异。
　　 4、癌组织与癌旁组织中Raf-1表达差异与患者性别、年龄、淋巴结转移情况、患者吸烟与否无显著相关性。
　　 5、癌组织与癌旁组织中Raf-1的Ser259磷酸化水平差异与患者性别、年龄、淋巴结转移情况、患者吸烟与否无显著相关性。
　　 结论：
　　 1、非小细胞肺癌的癌组织中Raf-1的mRNA及其蛋白表达水平与癌旁组织相比较呈明显上调。
　　 2、非小细胞肺癌的癌组织中Raf-1的Ser259位点磷酸化水平与癌旁组织相比较呈明显上调。