β-榄香烯对高氧诱导下新生小鼠视网膜新生血管凋亡的影响

摘要

目的：
　　 采用β-榄香烯(β-elemene)对视网膜新生血管病变进行干预治疗,观察β-榄香烯对视网膜新生血管内皮细胞早期凋亡的影响以及形态学特征,并探讨β-榄香烯与新生小鼠视网膜新生血管内皮细胞凋亡的关系,为β-榄香烯治疗新生血管疾病作基础实验的研究。
　　 方法：
　　 动物模型的建立以及分组:36只7日龄清洁级C57BL/6J小鼠随机分为3组,阳性对照组,阴性对照组,实验组.。在高氧环境下(75±2%)实验组和阳性对照组各12只鼠饲养5天,然后(12日龄)放入正常环境下饲养5天,诱导新生小鼠产生视网膜新生血管的动物模型。小鼠17日龄时,实验组行玻璃体内注射β-榄香烯,阳性对照组玻璃体内注射空白乳剂。阴性对照组正常环境下饲养10天,17日龄玻璃体内注射空白乳剂,不作其他任何处理。36只小鼠于21日龄全部深度麻醉致死,取小鼠右眼球常规石蜡包埋,进行4um连续切片,HE染色观察各组小鼠视网膜的结构以及计数突出于内界膜之外的新生血管内皮细胞核,确定动物模型的建模成功以及帮助排除Tunel染色的假阳性。
　　 Tunel法染色以及判定方法:采用Tunel法检测阴性对照组,阳性对照组,以及实验组中视网膜新生血管内皮细胞的凋亡情况。Tunel试剂盒(1、标记缓冲液(LabelingBuffer);2、末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT);3、DIG-dUTP;4、封闭液(BlockingReagent);5、生物素化抗地高辛抗体(×100);6、SABC(×100);7、ProteinaseK(×200);8、抗体稀释液)购于武汉博士德公司。DAB显色系统显色试剂,购于武汉博士德公司。结果判定方法:新生血管内皮细胞的凋亡的阳性反应为棕黄色颗粒定位于细胞核,有典型凋亡的形态特征:细胞体变小,染色体浓缩,核碎裂或者染色质沿核膜呈半月形边集或凋亡小体形成,即凋亡细胞。HE染色帮助排除假阳性,染色结果由俩位观察者采用盲法每个切片随机选择10个高倍视野(400×),计数200个突出于内界膜之外新生血管内皮细胞核中阳性细胞所占的百分比,即凋亡指数。统计结果均以均数士标准差(x±s)表示,对所得数据进行单样本t检验和样本非配对t检验,检验水准为α=0.05,p<0.05有统计学意义,所有数据均采用SPSSforwindows17.0统计学系统软件处理。
　　 结果：
　　 一、HE染色结果
　　 1、阴性对照组小鼠视网膜表面光滑,内核层和外核层细胞层次清晰,神经节细胞排列整齐,为正常视网膜结构组织。
　　 2、阳性对照组小鼠视网膜结构粗糙,视网膜增厚,大量新生血管形成,突出于内界膜外的新生血管芽明显可见,突出于内界膜外的新生血管内皮细胞核大量出现,相比阴性对照组有较大差异。
　　 3、实验组小鼠视网膜表面相对比较光滑,结构层次相对比较清晰,神经节细胞排列相对整齐,偶有缺失。
　　 二、Tunel染色结果
　　 1、阴性对照组视网膜无明显视网膜新生血管内皮细胞核突出于内界膜之外,视网膜表面光滑,内核层和外核层结构清晰,细胞排列完整,也未见明显的神经节细胞凋亡,为正常视网膜结构组织。
　　 2、阳性对照组可见视网膜结构粗糙,视网膜增厚,层次不清晰,神经节细胞排列紊乱,大量突出于内界膜之外的内皮细胞核中偶有散在的凋亡细胞分布于内界膜之外。
　　 3、实验组视网膜表面相对比较光滑,结构层次相对比较清晰,神经节细胞排列相对整齐,有较多凋亡细胞分布内界膜之外.
　　 4、阴性对照组凋亡指数为阴性,阳性对照组凋亡指数为1.21±0.50,实验组凋亡指数8.50±1.76。
　　 结论：
　　 1、本实验成功建立高氧诱导下的新生小鼠视网膜新生血管模型,β-榄香烯非常明显地促进了突出于内界膜外的视网膜新生血管内皮细胞的凋亡,视网膜正常结构未出现明显凋亡。β-榄香烯干预后视网膜新生血管减少,视网膜结构变的比较完整,神经节细胞排列相对整齐,内核层和外核层结构清晰可见。
　　 2、本实验通过对17日龄的C57/BL6J小鼠成功玻璃体内注射p-榄香烯,4天后取材观察(裂隙灯检查,HE染色,Tunel染色),证实β-榄香烯不引起眼内炎,晶体混浊,且无其他全身毒副作用,该方法对C57/BL6J小鼠安全可行。