TAK1siRNA基因沉默对RA滑膜细胞ATF2表达的影响

摘要

目的：
　　 要求培养滑膜原代细胞,制备良好的转染剂,然后将转染液导入滑膜细胞内,抑制人类风湿性关节炎滑膜细胞TAK1基因,给予体外刺激因素干预,检测ATF2表达量,为人类风湿性关节炎的治疗及研究提供基础及依据。
　　 方法：
　　 人类风湿性关节炎滑膜细胞体外实验培养,收集病人膝关节置换术、髋关节置换术中的类风湿性关节炎病人病变的类风湿性滑膜组织,采用酶消化法进行体外滑膜细胞的培养,在培养类风湿滑膜细胞的过程中,采用n型胶原酶及胰酶对标本进行消化体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长状念及细胞数量。定制sirNA转染试剂及转染诱导剂,制备可靠的特异性siRNA,将培养的类风湿细胞分组,采用体外的方式将转染剂导入需要检测的细胞内,抑制TAK1基因,然后给予刺激因素刺激完毕后,利用Elisa检测转录因子ATF2的表达情况。
　　 结果：
　　 该实验四例患者的滑膜细胞标本均采用体外消化培养法成功培养,平均传代至3～5代,细胞生长状态较好,比较稳定,大约传至第7代时细胞生长减慢,出现老化状态。免疫组化鉴定滑膜细胞均一地表达Vimetin(>95%)、表明所培养的细胞是滑膜成纤维细胞。设计的4组标本分别是实验组转染TAK1siRNA、阳性对照组转染GAPDHsiRNA、阴性对照组转染碱基错配siRNA、未转染细胞组,给予刺激因素刺激生长,经检测,实验组与对照组相比转录因子ATF2含量有明显的差异,呈现出组间差异,这表明,通过抑制TAK1可降低ATF2的转录活性,并可能进一步下调炎性因子的释放及作用,以降低对骨与软骨的损伤。
　　 结论：
　　 成功提取类风湿性关节炎滑膜原代细胞,并进行培养,为之后的实验打下良好的基础。定制转染试剂,将其成功转入细胞内,通过对TAK1激酶的抑制来降低ATF2的转录活性,为治疗类风湿性关节炎奠定的良好的基础。