男性不育相关基因在精液中的筛查及分析

摘要

目的：
　　 全世界约有10-15%的夫妻受到不育症的困扰,男性因素约占50%。越来越多的证据表明,不育症的发生与遗传因素相关。所以,对男性不育相关基因进行筛查,并对其引发不育症的机制进行探索是十分必要的。目前,在基因表达水平对男性不育症进行分析,通常需要获得患者的睾丸组织。睾丸活检是一种有创手术,应用于对无精患者的诊断与治疗中(检测睾丸内是否存在精子,行取精术利用辅助生殖技术孕育后代),正常人及大多数男性不育患者的睾丸组织不易获得。不育患者精液中精子过少或没有精子,以及精子内的基因表达不能代表全睾丸内的基因表达情况是精液遗传学检测被忽视的原因。我们推测,精液中除含有精子外,还存在着其它类型睾丸细胞及这些细胞的基因表达信息。在没有睾丸组织的情况下,以精液为样本进行相关基因的检测也可以对睾丸内的基因表达情况有一个较为全面的了解。本研究旨在利用无创取材样本对男性不育相关基因进行筛查,对不育症发生机制进行探索,同时亦为无精症患者的无创诊断提供依据。
　　 方法：
　　 在前期研究工作获得的“339个小鼠睾丸特异表达基因”基础上,选择在人体中表达特异性强且丰度高的各类型睾丸细胞标志基因作为候选基因,共80个。提取2例正常男性睾丸RNA,反转为cDNA,分别稀释为1/10、1/100和1/1000倍后,检测各候选基因的表达。2例正常男性任-1/1000倍cDNA组检测结果为阳性,即可认为该候选基因检验敏感性良好,选择这些基因进行下一步检测。分别提取正常人精液沉淀和上清两部分RNA,反转为cDNA后,PCR方法检测上一步获得的检验敏感性好的基因的表达,筛选出沉淀和上清中表达频率均大于50%的高频基因。分别提取弱精患者、无精患者精液沉淀和上清RNA,反转录为cDNA,检测弱精患者、无精患者精液沉淀和上清中高频基因的表达。利用SPSS17.0软件分析高频基因在正常人、弱精患者和无精患者精液中的表达是否存在差异,并比较高频基因在所有精液样本沉淀、上清、全精液(沉淀+上清)中的检测结果,同时,对高频基因在精液沉淀和上清中的检测结果的一致性程度进行分析。
　　 结果：
　　 1、Kitlg、Akap4在弱精患者精液中表达频率下调,Akap4,Tnp1、Spata3,Prm1、Prm2在无精患者精液中表达频率下调。
　　 2、部分精液样本上清检测结果对沉淀检测结果有“补偿”作用,高频基因在全精液中检测的检出率明显高于仅在精液沉淀或上清中检测。
　　 3、Pou5f1等8个高频基因在精液沉淀和上清中检验一致性较高,Sbf1基因在正常人精液沉淀和上清中检测一致性稍低。
　　 结论：
　　 1、正常人、弱精患者、无精患者的精液沉淀和上清中可检测到精子和其它类型睾丸细胞的标志基因。
　　 2、Kitlg、Akap4,Tnp1、Spata3,Prm1、Prm2的表达异常可能与男性不育症发生相关。
　　 3、同时在精液沉淀和上清中检测基因的表达可提高检测灵敏度。