胞浆小滴与精子运动相关性及参与精子能量代谢机制研究

摘要

目的：
　　精子的运动功能或运动能力的强弱直接关系到人类的生殖能力。只有正常作前向运动的精子才能确保精子抵达输卵管壶腹部与卵子结合形成受精卵。据国内文献报道，因精子活力低下而导致的男性不育约占30％。胞浆小滴(Cytoplasmdroplets，CD)是生殖细胞大部分被支持细胞所吞噬后细胞质的残存体，留存于精子颈/体部。作为精子的附属结构，临床医生认为精子CD的残留是导致精子活力低下的重要原因之一，将CD的存在与不育症联系在一起;而基础科学家认为CD是有正常功能的精子正常的结构特点。CD的功能及其作用机理至今仍然不清楚。
　　在绝大多数哺乳动物物种中，精子成熟的典型特征之一是附睾精子的CD结构从精子中段近端移动到远端，CD被保存在大多数哺乳动物附睾尾部精子中。近期科学家们关于CD的相关研究已经有一些有价值的发现，认为CD在调节精子渗透压方面起到了重要的作用;在CD中发现两种标志性物质-泛素和15-脂氧化酶;CD中含有的P450芳香化酶与雄激素产生有关，参与了附睾内精子成熟的调节等。
　　在精子从附睾头部相对静止的状态到射精后精子的超激活运动，CD经历了从精子中段近端移动到远端，最后被完全脱去的过程。但是，除了CD能够调节渗透压之外，CD中究竟包含何种成份、CD通过何种分子途径影响精子的运动能力的还需要进一步研究，目前尚无相关报导。因此，在本研究中，我们通过实验将明确CD在精子不同成熟时期及射精后与精子运动的关系，同时深入研究CD的形态及蛋白组学构成，从而分析精子从睾丸释放至射精后这一时间段内CD与精子的成熟有何相关性和作用机制，从不同角度阐述CD与精子运动能力的关系，为男性不育的机理及临床诊断与治疗提供了新的思路。
　　材料与方法：
　　一、实验材料
　　1、不同品种（系）(C57BL/6J，FVB，ICR)小鼠选购于中国医科大学实验动物部，为健康雄性及雌性，周龄8-16周。
　　2、电镜检测相关试剂
　　3、免疫荧光检测相关试剂
　　4、Western Blot相关试剂
　　5、蛋白质谱分析相关试剂
　　二、实验方法
　　（一）小鼠附睾精子计数
　　1、计数不同品种（系）小鼠附睾精子在附睾各部位（头，体，尾）处有CD和无CD结构的精子数量，并分类计数游动精子与不游动精子数量，进行统计学分析。
　　2、根据CD在精子的不同位置（头/颈部、中段、尾部）分类计数不同品种（系）(C57BL/6J，FVB，ICR)小鼠的附睾精子，进行统计学分析。
　　（二）小鼠射精后雌鼠生殖道精子计数
　　雌雄鼠交配后，计数雌鼠的子宫及阴道内精子有CD及无CD精子数量。
　　（三）胞浆小滴的提取
　　切取小鼠的附睾，获取精子悬液。应用非连续性蔗糖密度梯度离心法提取CD的游离体。
　　（四）免疫荧光检测CD纯度
　　CD沉淀加入少量PBS溶液混匀，取出一滴涂片后风干。无水乙醇固定3-5分钟，风干。用4％多聚甲醛固定并在4℃含0.5％ Triton X-100 PBS缓冲液中
　　放置2分钟。一抗（兔抗鼠SPEM1和UBlQUITIN）室温下加入荧光素标记的二抗孵育1小时，用1×PBS冲洗3次，荧光显微镜下观察CD的纯度。
　　（五）电镜样本制作
　　将CD提取物离心2次，吸取沉淀物，加入3％-4％戊二醛2ml固定30min，用0.2mol/L磷酸缓冲液离心洗涤3次，沉淀物中加入1％锇酸处理后，离心沉淀分成2份，一份用1％琼脂包埋，经50％～100％浓度梯度乙醇脱水，环氧丙烷渗透，过夜。Epon812包埋、切片、醋酸铀和枸橼铅染色、透射电镜下观察并拍照。另一份用50％、70％、90％和100％乙醇做梯度脱水，每次15分钟，离心3000r/min，5分钟。临界点干燥后离子溅射仪喷金，时间80秒、电流15mA、真空7-10Pa，用于扫描电镜观察并拍照。
　　（六） Western Blot免疫印迹检测
　　使用裂解液分别取各组精子的蛋白质，然后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转印、脱脂奶粉中封闭过夜、一抗（LDHC和PGK2）孵育、辣根过氧化物酶标记的二抗孵育以及ECL发光，成像后进行图像分析。
　　（七）胞浆小滴蛋白质谱分析
　　SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白总的精子蛋白、CD蛋白及剩余精子蛋白，使用考马斯亮兰染色方法找出CD组中的差异蛋白条带。切取差异蛋白条带后，经过还原以及使用乙腈进行乙酰胺基化处理后，使用ABI4700 MALDI TOF/TOF分析仪分析并收集蛋白数据。
　　（八）统计方法
　　所得数据采用SPSS软件（18.0版）进行统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　一、胞浆小滴与附睾精子运动的相关性
　　不同品系小鼠附睾头部游动的精子数量明显少于不游动精子数量。精子运动在附睾体部明显加强，尾部精子运动能力最强。精子游动组与不游动组有CD精子所占的比例有显著差异(p＜0.01)。说明在附睾精子中CD与精子的运动有相关性。
　　二、胞浆小滴在精子上不同位置与精子运动的相关性
　　不同品种（系）小鼠附睾头、体部及尾部游动组精子中，CD在精子不同位置所占比例有显著不同。当CD位于精子中部时，与其他部位相比较有显著差异(p＜0.01)。说明CD位于精子中部时与精子的运动有相关性。
　　三、交配后雌鼠生殖道内精子胞浆小滴被脱去
　　精子射精后进入雌鼠生殖道内，几乎只有很少数量的精子还有CD留存，绝大多数精子的CD结构消失。说明正常的精子射精后CD被脱去。
　　四、胞浆小滴纯化
　　通过非连续蔗糖密度梯度离心法可以提取得到高纯度的CD。镜检未见残存精子。可用于进一步实验。
　　五、扫描电镜下胞浆小滴形态
　　扫描电镜下CD的形状几乎与光镜下观察到的CD完全相同。呈球形或双丸状，外表不光滑，可见多个膜样的小泡，大小不均匀。直径大约为2μm。六、透射电镜下胞浆小滴形态
　　透射电镜下观察CD直径大约为2.3μm，内可见膜样结构，不同CD细胞基质的密度有较大差别。部分CD含有中度电子致密物。但有一些CD的基质密度明显减低，有可能是内容物在脱离精子时丢失。CD的外膜看起来是连续性的，看不到脱离精子时膜的破裂。
　　七、Western Blot结果
　　为了证实LDHC和PGK2确实存在于CD中，而且CD中的含量高于精子膜，我们用Western Blot法检测全精子、游离的CD和脱去CD后剩余精子的蛋白质水平。结果显示LDHC在游离的CD和全精子组中含量较高，而PGK2则仅在游离的CD中含量较高。
　　八、蛋白质谱分析结果
　　质谱分析检测出纯化的CD中有105种蛋白，这些蛋白可以被分为8类。其中细胞骨架蛋白约占8％、转运蛋白约占1％、糖蛋白约占1％、热休克蛋白约占1％、脂蛋白约占3％、核蛋白质约占2％，其它稀有蛋白质约占9％，而这些蛋白质中约68％是酶。
　　结论：
　　1、当精子在附睾成熟过程中，位于精子中段CD的存在是精子成熟过程中的正常结构;CD在射精后应从精子上正常脱落。
　　2、CD的存在与精子的运动能力有相关性，CD存在的位置对精子运动有显著影响，当CD位于精子中段时精子的运动能力最佳。
　　3、CD的主要蛋白成份为酶蛋白，其中约40％为能量代谢相关蛋白酶。
　　4、CD与精子的能量代谢密切相关，可能是为精子的活动提供能量的重要物质基础。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 胞浆小滴对精子活动力影响的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 胞浆小滴与精子获能的相关研究及蛋白组学分析

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 精子生成障碍的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介