在氨基酸反应中探讨左旋门冬酰胺酶杀伤MOLT-4细胞的机制

摘要

目的：
　　 左旋门冬酰胺酶(L-asparaginase，L-asp)是治疗儿童急性淋巴细胞白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)的重要化疗药物之一。单独使用L-asp可以使儿童ALL的完全缓解率达到40％-60％。其作用机制如下：它可以水解血液/培养液中的门冬酰胺，导致细胞内的门冬酰胺水平降低，令细胞蛋白质合成受阻，细胞趋于凋亡。尽管L-asp是一种历时弥久的老药，但其杀伤细胞的具体分子机制仍不清楚。
　　 本实验通过对T淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4进行体外实验，研究L-asp对MOLT-4细胞的增殖抑制作用，并观察ASNS、CHOP、Bax及Bcl2mRNA在L-asp作用后不同时间点的表达情况，从中探讨可能存在的凋亡机制。这在国内外文献未见报道，本研究将为L-asp的作用机制提供新的理论依据。
　　 方法：
　　 一、细胞培养及胎盼兰拒染法检测细胞存活率
　　 将MOLT-4细胞进行复苏培养，急性T淋巴细胞白血病MOLT-4细胞株，置于含10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内培养，每2d至3d传代1次。取对数生长期细胞，接种至6孔培养板，细胞浓度为5×105/ml。培养24h后实验分组如下：1.对照组(细胞培养液中不加任何药物)；2.实验组：用1IU/mlL-asp处理。实验组和对照组分别于加药处理后的12h，18h，24h，48h，96h计数活细胞数。计数时先制备细胞悬液，用0.2％台盼蓝染色以判定细胞活性(活细胞不着色)，取少量细胞悬液滴于细胞计数板上，显微镜下计数。
　　 二、实时定量荧光PCR
　　 分别收集用1IU/ml的L-asp处理后的MOLT-4细胞，提取总RNA，按试剂盒说明书配置逆转录反应体系合成cDNA；引物由Takara公司设计合成，采用SYBRGreenⅠ实时定量荧光PCR方法，以GAPDH为内参照，进行SYRBGreenⅠ实时荧光定量PCR，检测ASNS、CHOP、Bax及Bcl2mRNA表达水平。
　　 三、结果判断
　　 将标准品cDNA10倍浓度梯度稀释为5-6个浓度梯度，各取2μL作为模板进行RealTime PCR反应，由各扩增曲线得到的CT值制作标准曲线，从而得到样本的拷贝数。以GAPDH作为内参照，CHOP，ASNS，Bcl2及Bax作为目的基因，通过目的基因和内参基因拷贝数的比值进行样本间相对定量的比较。
　　 四、统计学分析
　　 采用SAS(SAS for Windows，9.2版本)软件进行统计分析。实验结果用(x-±s)表示，应用Wilcoxon-Mann-Whitney检验考察目的基因的相对mRNA表达水平在不同的时间点的差异表达情况。
　　 结果：
　　 一、方法的可靠性和准确性
　　 1、RNA的纯度和质量分析
　　 所提取的总RNA经紫外分光光度计检测，比值在1.8-2.0之间，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带清晰可见，无明显降解。
　　 2、扩增的特异性及定量的准确性
　　 标准品cDNA经梯度稀释后进行PCR反应，制作标准曲线。得到的标准曲线相关系数(r2)均>0.998，斜率在-3.3至-3.5之间，反映定量准确，扩增效率良好。扩增后溶解曲线显示锐利的单一锋，无其他非特异性锋，说明扩增产物均一，无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增片段的均一性及长度。
　　 二、1IU/mlL-asp对MOLT-4细胞增殖的影响
　　 1Iu/mlL-asp作用于MOLT-4细胞的0-96h内，在不同时间点测得的细胞存活率与细胞存活数。18h之前实验组与对照组的细胞存活率无显著差异(P>0.05)，实验组细胞存活数自24h后开始显著下降(与18h及48h相比较，P<0.05)，72h时细胞几乎全部死亡；实验组与对照组的细胞存活率在0-12h内差异不显著(P>0.05)，自18h开始实验组细胞存活率显著下降(L-asp作用后的18h与12h及24h相比较，P<0.05)。
　　 三、L-asp对MOLT-4细胞CHOP，ASNS，Bcl2及BaxmRNA表达的影响
　　 在L-asp用药后的8h和18hCHOP与ASNSmRNA出现两次表达高峰，18h后CHOPmRNA水平仍维持在较高水平，ASNSmRNA开始逐渐下降；Bax/Bcl2比值也于18h后显著升高。
　　 结论：
　　 左旋门冬酰胺酶杀伤MOLT-4细胞可能存在下列机制：CHOP蛋白通过上调Bax/Bcl2比值激活线粒体凋亡途径；CHOP蛋白通过抑制抗凋亡基因ASNS的表达杀伤细胞。