输尿管部分梗阻大鼠肾脏不可逆损伤分泌蛋白质标记物初步筛查研究

摘要

前言:
　　 随着发达国家产前超声的应用增加和普及,新生儿中先天性梗阻性肾病的检出率逐渐增加。普遍认为梗阻性肾病是肾盂和集合系统内尿液蓄积诱导产生的肾积水导致的结果。尽管梗阻性肾病的病因不清,但是最常见的原因是肾盂输尿管连接部(Uretero pelvic junction,UPJ)梗阻,这是儿童泌尿外科常见的疾病,尽管全世界很多研究人员致力于该病的基础和临床研究,但仍然存在很多亟待解决的问题。如何治疗UPJ梗阻的新生儿一直处于争论中。在20世纪80年代晚期之前,为了避免肾脏功能恶化,先天性输尿管梗阻的新生儿治疗原则都是生后立即进行手术。然而,临床上观察到很多UPJ患儿肾积水可以自发消失,并不出现肾功能丧失或肾脏发育异常。鉴于这种情况,就需要修改UPJ梗阻新生儿的治疗规范。目前,很多临床医生对于UPJ梗阻新生儿多采取保守观察的态度,只有当检测到肾脏功能减退时才采取外科手术干预。尽管这种治疗态度避免了很多不必要的外科干预,但还是存在三大方面的问题:(1)目前临床上应用的检测肾功能损伤程度的检查方法还不完善;(2)这些检查方法多是有创性的,而且需要UPJ梗阻患儿在生后的最初一年内反复接受检查来评价肾功能受损程度;(3)部分输尿管梗阻对肾脏功能造成的远期影响知之甚少,保守观察过程中即使密切随访也存在造成肾脏不可逆损伤的风险。
　　 目前,国内外对于先天性肾积水的诊断和手术时机的选择仍依赖于影像学检查方法,将新生儿肾积水随访过程中肾积水程度加重或出现肾脏功能恶化作为手术的指征,还没有无创性生物学标记物检查可以早期诊断肾脏不可逆损伤和输尿管梗阻,从而减少或替代临床现行的有创性检查。因此,对于新生儿肾积水以及梗阻性肾病,目前临床上需要筛选一种输尿管梗阻后肾脏不可逆损伤的特异性标志物,早期发现肾脏不可逆损伤,并给予及时手术治疗和临床干预,减轻肾脏损伤,以保存剩余的肾脏功能。
　　 蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质组成和变化的新学科,它对于疾病的早期诊断和发病机制都具有重要意义。分泌蛋白质组属于亚蛋白质组的一员,是指能够分泌到细胞外的蛋白质总和,近年来多应用于血清和尿液中疾病标志物的研究。肾脏病理性改变经常由肾脏组织的破坏和重塑引起,这些组织上的异常也会引起某些蛋白表达水平的改变。由于肾脏疾病而产生的蛋白都能以原形或降解的的肽段的形式出现在尿液中,使尿液呈现特异的蛋白质谱,这种蛋白质谱的出现可反应疾病的病理生理过程。同时,由于尿液蛋白质谱的改变可能早于临床症状的出现,使之有可能成为预测或早期诊断疾病的手段。
　　 许多体内外实验研究表明肾小管上皮细胞间质转化是肾脏发生纤维化的一个关键步骤,肾脏小管上皮细胞表型的改变和缺失可能启动了肾脏不可逆损伤。因此本研究以此为突破点,研究肾脏小管上皮细胞间质转化即肾脏发生不可逆损伤前后的体液(血清、尿液)中分泌蛋白质组,筛查输尿管梗阻后肾脏不可逆损伤的特异性标志物。
　　 表面增强激光解析电离-飞行时间质谱(surfaceenhancedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometry,SELDI-TOF-MS)技术是一种高通量、高灵敏的蛋白质检测技术,检测所需样本量少、自动化程度高,可以检测样本中低丰度蛋白,为体液中分泌蛋白质检测提供了一个很好的技术平台,目前已广泛应用于肿瘤、遗传性疾病、中枢神经系统性疾病、肾脏疾病的基础研究。本研究拟应用SELDI-TOF-MS技术,检测正常大鼠、输尿管部分梗阻大鼠肾小管上皮细胞转化组的血清、尿液,与体外肾小管上皮细胞间质转化模型实验检测结果对比分析,筛选出一组特异性标志物,为先天性肾积水及梗阻性肾病选择适宜的手术及治疗时机提供依据。
　　 实验材料:
　　 一、实验动物
　　 SPF级SD大鼠(140-160g)6只,SPF级SD大鼠(100-120g)78只,由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。
　　 二、实验试剂
　　 兔抗大鼠细胞角蛋白抗体(CKl8)(北京博奥森,中国)
　　 兔抗大鼠E钙粘蛋白抗体(E-cadherin)(北京博奥森,中国)
　　 小鼠抗大鼠平滑肌细胞肌动蛋白抗体(α-SMA)(武汉博士德,中国)
　　 兔抗大鼠波形蛋白抗体(Vimentin)(北京中杉,中国)
　　 FITC标记羊抗兔抗体(北京中杉,中国)
　　 罗丹明标记羊抗小鼠抗体(康为世纪,中国)
　　 DAPI染色液(Sigma,USA)
　　 胰蛋白酶(Sigma,USA)
　　 胎牛血清(Hyclone,美国)
　　 DMEM/F12细胞培养基(Hyclone,美国)
　　 胰岛素(Sigma,美国)
　　 氢化可的松(赤峰蒙欣药业)
　　 青霉素(华北制药厂)
　　 链霉素(华北制药厂)
　　 三氟乙酸;醋酸钠;二硫苏糖醇;3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐;尿素;乙腈;饱和芥子酸。(Sigma,美国)
　　 三、蛋白质芯片
　　 选用SELDI蛋白质芯片中CM10芯片,CM10芯片是弱阳离子亲和芯片WCX2芯片的改进型。购于美国Ciphergen公司。
　　 实验方法
　　 实验组大鼠(n=48)随机分为梗阻12小时、1天、2天、3天、5天、7天等6个时间段组,每组8只,空白对照组(n=30),制作输尿管部分梗阻模型,于不同时间点分别处死大鼠,分别取双侧。肾脏制作石蜡切片、腹主动脉穿刺获取血清,肾盂或膀胱穿刺获取尿液,-80摄氏度保存。应用免疫荧光双标方法确定动物模型中肾小管上皮细胞发生上皮间质转化的时间点,同时原代培养肾小管上皮细胞,利用吹吸方法使肾小管上皮细胞在流体机械力作用下发生上皮间质转化,取转化前后的细胞培养上清,分装,-80摄氏度冻存。选取动物模型肾小管上皮细胞转化前后收集的尿液、血清标本以及体外培养的肾小管上皮细胞转化前后细胞培养上清,利用SELDI-TOF-MS技术筛选出三种不同样本肾小管上皮细胞间质转化前后的标志物。
　　 结果:
　　 1、成功建立了大鼠单侧输尿管部分梗阻(PUUO)模型。
　　 2、大鼠PUUO模型的手术侧肾脏可用于研究肾间质纤维化。
　　 3、大鼠肾间质纤维化过程中肾小管上皮细胞存在上皮间质转化现象。
　　 4、间歇性流体机械力可以使体外培养的肾小管上皮细胞发生上皮间质转化现象。
　　 5、发现输尿管部分梗阻大鼠血清中有27种蛋白质标记物,其中10种蛋白质高表达,17种蛋白质低表达。输尿管部分梗阻大鼠尿液中共检测到27种蛋白质标记物,有8种蛋白质高表达,19种蛋白质低表达。体外培养肾小管上皮细胞转化前后培养上清共有10个差异蛋白峰,肾小管上皮细胞转化后10种蛋白质均低表达。
　　 结论:
　　 大鼠PUUO术后3天即有肾小管上皮细胞表达成纤维细胞标志物,发生细胞表型转化,即发生上皮间质转化,随梗阻时间延长,肾脏中发生转化的肾小管上皮细胞逐渐增多。
　　 大鼠肾小管上皮细胞在流体机械力诱导下向成纤维样细胞分化,从而可能在流体机械力介导的肾间质纤维化中起作用。
　　 应用SELDI-TOF-MS技术筛查出输尿管部分梗阻前后大鼠血清的差异蛋白峰27个,这些差异蛋白峰可能是输尿管部分梗阻大鼠血清的特异性蛋白质标志物。
　　 输尿管部分梗阻大鼠尿液和体外培养肾小管上皮细胞转化后培养上清中可能共有的蛋白质相对分子量为1187,该蛋白质可能是输尿管部分梗阻大鼠肾盂尿液和体外肾小管转化后细胞上清液中共有的蛋白质标志物。