GC-MS衍生化法检测亚硝酸盐及其在菌尿筛查中的应用

摘要

目的：
　　 亚硝酸根NO2-是水溶性的无机阴离子,存在广泛,可引起中毒,具有潜在的致癌性,同时也是一种法定限量使用的食品添加剂。NO2-在生物样品中的提取难度大,气相色谱质谱联用法不能直接检测。本研究对比了两种取代基位置不同的二氨基萘衍生化试剂,优选出适宜血浆和尿液的GC-MS衍生化方法并尝试在菌尿筛查中应用,反映细菌对检材中NO2-定量检测的重要影响。
　　 方法：
　　 取血浆(或尿液)0.5ml于试管中,加入10μgNO2-(以阴离子计算),随后加入内标,pH=3缓冲溶液和二氨基萘衍生化试剂,涡旋震荡30s。将试管密封,于60℃恒温加热15min。待冷却后,加入碳酸铵调至pH≈8.5,加入2ml乙酸乙酯萃取,震荡1min,3500r/min离心5min,取上清液N2下浓缩,吸取1μl进样分析。将优选出的衍生化方法用于检测干化学筛查阳性的14个尿液样品和2个阴性样品。使用岛津GC-MSQP2010,EI源,获得的质谱数据用NIST谱库检索。
　　 结果：
　　 2,3-二氨基萘与NO2-的衍生产物保留时间为10.86min;特征离子峰为:m/z114、m/z141、m/z169。1,8-二氨基萘衍生物的保留时间为10.04min,特征离子同上,质谱图整体地貌相似。2,3-二氨基萘血浆标准曲线的相关性0.995(y=0.2470X-0.1783),尿液标准曲线的相关性0.997(y=0.2391X-0.1411);1,8-二氨基萘血浆标准曲线相关性0.984(y=0.3783X-0.3901),尿液标准曲线相关性0.983(y=0.2303X-0.2927)。2,3-二氨基萘衍生化方法血浆LOD0.05μg/ml,尿液LOD0.01μg/ml,日内精密度血浆3.87～4.61%,尿液3.31～4.06%,血浆中回收率98.77～115.6%,尿液中回收率102.3～113.5%;1,8-二氨基萘衍生化方法血浆LOD0.1μg/ml,尿液LOD0.05μg/ml,日内精密度血浆3.54～5.63%,尿液3.49～4.31%,血浆中回收率107.7～119.2%,尿液中回收率103.5～116.0%。由此可见2,3-二氨基萘衍生化法优于1,8-二氨基萘衍生化法。GC-MS衍生化法精确定量结果显示干化学阴性尿液亦能检出亚硝酸盐,并且不同等级间差异显著。
　　 结论：
　　 2,3-二氨基萘衍生化法检测亚硝酸盐具有可操作性强,成本低,易于普及的特点,同时具有较好的精密度和准确性。应用于菌尿筛查时,不仅可以检出阴性尿液中的亚硝酸盐,而且可以排除其他药物(化合物)的干扰,弥补干化学半定量检测不足,检材检出亚硝酸盐阳性,注意排除细菌干扰。