β-榄香烯诱导的缺氧诱导因子对其引发MG-63细胞凋亡的保护作用研究

摘要

目的:
　　 榄香烯是从中药莪术中提取的抗癌药物,β-榄香烯是其主要活性成分,目前研究表明β-榄香烯由于药物的毒副作用较小,已在抗癌领域被逐渐接受,并且表现出良好的抗癌效果。但是关于榄香烯治疗骨肉瘤目前尚无人报道。我们应用不同浓度的榄香烯作用于人骨肉瘤细胞系MG-63细胞,观察其对细胞增殖和凋亡的影响。并探索其凋亡的机制。目前对于骨肉瘤的治疗主要是手术配合化疗,但是化疗会经常会有耐药现象产生影响了药物本身的效果。而缺氧诱导因子与这样的现象有密切的关系。我们通过实验论证在β-榄香烯作用过程中缺氧诱导因子是否会发生量的变化,以及分析其发生变化的机制,进而论证这种变化对细胞凋亡存活的影响,及对化疗效果的影响。最后应用转染和干扰技术验证缺氧诱导因子对细胞凋亡和存活的影响。对临床的治疗提供科学的依据。
　　 方法:
　　 1、成骨细胞加入榄香烯后的增殖率测定。
　　 MG-63细胞接种于96孔培养板,每孔0.1ml培养基,24h后细胞贴壁,更换培养液,分别加入不同浓度的β-榄香烯,复合培养24,48和72h后。加入MTT,酶标仪测量490nm波长的吸光度值(OD)。分析细胞的增殖和凋亡情况。
　　 2、成骨细胞细胞周期检测。
　　 加入榄香烯复合培养后,加入配制好的PI染液于37度水浴中避光孵育30分钟。孵育好的细胞采用流式细胞术上机检测细胞周期情况。
　　 3、应用流式细胞术,采用ANNEXIN-V和PI双染检测各组别的凋亡情况。
　　 加入榄香烯复合培养后,加入ANNEXIN-V染液10μL,及PI染液5μL,避光孵育10分钟后,上机检测。
　　 4、Wrestern-boll检测MG-63细胞cyto-C,Bax,AIF,caspase3,9等凋亡相关蛋白及HIF-1α蛋白和PI3k/AKT/mTor信号通路相关蛋白的表达情况。
　　 加入蛋白裂解液裂解。收集蛋白样品后测定蛋白样品的浓度,加入适量的上样缓冲液,煮沸5分钟后,冷却到室温后就可以上样,将样品加入到SDS-PAGE加样孔内以恒压80v跑电泳90-120分钟,电泳后转到PVDF膜上,采用恒流300mA转膜2小时,封闭两小时后,用相应抗体孵育过夜,第二日清晨加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2小时,最后采用ECL试剂来检测。
　　 5、免疫荧光检测各组MG-63细胞HIF-1α蛋白的表达情况。
　　 加入榄香烯复合培养后,收集细胞,再以4%的多聚甲醛固定1小时。加入0.2%的曲拉通做透化处理,在吸尽封闭液后加入(1:100)的HIF-1α抗体在4℃条件下孵育过夜。用PBS缓冲液冲洗孑L板,吸取一抗残液,避光下分别加入TRITC标记的二抗,37℃孵育1小时,后在加入(1:100)的Hest33342染核处理,经过PBS冲洗后在荧光显微镜下观察,并拍照。
　　 6、应用流式细胞术,采用ROS检测试剂盒检测各组别的ROS情况。
　　 细胞内的ROS水平采用DCFH-DA荧光探针进行检测。加入处理药物作用后加入终浓度30μM的DCFH-DA于37℃孵育1h,每5min震荡细胞一次。用无血清的D-MEM培养基沈细胞3次后,用流式细胞术检测。
　　 7、RT-PCR检测各组MG-63细胞HIF-1αmRNA的表达情况。
　　 加入榄香烯复合培养后,收集细胞总RNA,反转,PCR扩增,然后将PCR产物做琼脂糖凝胶电泳,并作分析。
　　 8、稳定表达HIF-1α细胞株的建立和鉴定。
　　 p-EGFP-C2空质粒和pHIF-1α/EGFP-C2质粒转染MG-63细胞,经过G418筛选14天后,提取转染细胞的RNA和总蛋白做鉴定。
　　 9、RNA干扰抑制HIF-1α的表达。
　　 将干扰质粒转染人骨肉瘤细胞系MG-63细胞,提取转染细胞的RNA和总蛋白做鉴定。检测干扰效果。
　　 10、统计学处理。
　　 数据均以均数士标准差表示,采用SPSS17.0软件包进行统计学处理,各组间比较采用单因素方差分析,样本均数间的两两比较采用LSD-t检验,以P＜0.05为差异有显著性。
　　 结果:
　　 1、榄香烯处理MG-63细胞后,细胞生存率逐渐减小,细胞凋亡明显增加,具有剂量依赖性和时间依赖性的特点。
　　 2、加入榄香烯后,细胞周期停留于G0/G1期,处于G0/G1阻滞,细胞的增殖受到了抑制。
　　 3、榄香烯引起的MG-63细胞凋亡是一种线粒体依赖的凋亡。榄香烯同时激活了caspase依赖性的和caspase非依赖性的两条凋亡途径。
　　 4、加入榄香烯后,发现HIF-1α的表达增加。无论是从蛋白水平还是转录水平,加入榄香烯后,HIF-1α的表达明显增加。
　　 5、β-榄香烯作用的最初阶段,即在细胞凋亡早期,PI3K/AKT/mTor信号通路是激活的,通过激活此通路,增加了HIF-1α蛋白的表达。
　　 6、ROS的高表达是HIF-1α的表达增加的一个原因,并且ROS的促进HIF-1α表达的作用远远大于PI3K/AKT/mTor信号通路。
　　 7、稳定表达HIF-1α的细胞株的建立。通过质粒转染和筛选我们建立了稳定表达HIF-1α的细胞株。
　　 8、SiRNA干扰抑制HIF-1α的表达。我们将干扰质粒转到细胞内,抑制HIF-1α的表达。
　　 9、HIF-1α对榄香烯诱导MG-63细胞凋亡有保护作用。
　　 10、榄香烯配合HIF-1α的SiRNA干扰或HIF-1α的特异性抑制剂能大大提高榄香烯的诱导骨肉瘤细胞株MG-63细胞的凋亡效果。
　　 结论:
　　 1、榄香烯能够引起人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡,并且具有剂量依赖性和时间依赖性的特点。
　　 2、榄香烯在引起人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡的过程中,诱导了缺氧诱导因子的高表达。
　　 3、PI3K/AKT/mTor信号传导通路和ROS在榄香烯诱导缺氧诱导因子的高表达的过程中发挥重要的作用。
　　 4、HIF-1α对榄香烯在引起人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡具有保护作用。过表达HIF-1α时对榄香烯的抵抗明显增加,干扰和抑制HIF-1α后细胞对榄香烯的敏感性也增加了。