RNA靶向干扰PIN1基因表达对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响

摘要

前言:
　　 喉鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,过去的10年中,我国喉癌的发病率呈现上升的趋势,我国东北是喉癌的高发地区。喉癌对放疗及化疗均不敏感,手术是目前治疗的主要手段,但手术会给患者造成不同程度的损伤。因此实现对喉癌的早期发现、早期诊断,并在基因水平寻找新的治疗手段为当前急待解决的问题。目前,喉癌的发生机制尚不明确,探索喉癌发生机制,将有助于解决喉癌防治的关键问题,因此发现喉癌发生相关基因、探索喉癌发生机制已经成为喉癌研究的热点问题。
　　 PIN1是一种高度保守的、特异的肽基脯氨酰基顺/反异构酶,能特异性地催化磷酸化的丝氨酸、苏氨酸脯氨酸基序发生异构,由顺式变为反式,调节底物蛋白。研究表明其过表达与肿瘤发生发展有关,被称为肿瘤发生发展的催化因子。
　　 RNA干扰是转录后水平封闭或沉默相应基因表达的新基因阻断技术,近几年成为基因治疗研究的热点。其原理是小片段RNA利用碱基互补的原理,特异性地结合癌基因的mRNA并将其降解,干扰其形成蛋白质的功能,阻抑癌蛋白的生成。使癌细胞向成熟方向分化或诱导细胞凋亡,从而达到抑制肿瘤细胞恶性增殖的目的。
　　 喉癌和其它肿瘤一样,是一种多基因,多步骤,多阶段的发生过程,发病机制复杂,治疗困难。是否可以利用RNAi技术沉默喉癌细胞中PIN1基因的表达,以达到阻止或减缓肿瘤细胞生长的目的尚属未知领域。本研究旨在探讨RNA干扰PIN1基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡、侵袭转移、及中心体扩增等生物学行为影响,探索有效的治疗靶基因、寻找理想的标志物,为喉癌的生物学治疗提供新的分子靶点和理论依据。
　　 材料与方法:
　　 一、实验材料:
　　 (1)喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系,感受态大肠杆菌JM109。
　　 (2)主要分子生物学相关试剂:RPMI1640培养基,胎牛血清,TRIzol,脂质体转染试剂盒,Taq酶,琼脂糖,反转录试剂盒,pSilencerTM4.1-CMV质粒,Control-shRNA载体,鼠抗γ微管蛋白单克隆抗体,兔抗β-Actin蛋白单克隆抗体,兔抗PIN1蛋白单克隆抗体,辣根酶标记山羊抗兔lgG,FITC标记山羊抗鼠IgG(γ微管蛋白特异性),QIAGEN质粒中量提取试剂盒。
　　 二、实验方法:
　　 1.构建PIN1基因的重组载体
　　 2.应用RT-PCR方法检测喉癌组织、Hep-2细胞和HEK293细胞中PIN1基因mRNA表达情况。
　　 3.用脂质体将重组质粒PIN1-shRNA转染Hep-2细胞,同时以转染Control-shRNA载体组和未处理组作为对照。(分别命名为Hep-2/p-shRNA组、Hep-2/p-Con组和Hep-2组)。
　　 4.RT-PCR和WestemBlot检测靶向干扰Hep-2细胞PIN1基因后mRNA和蛋白的表达水平。
　　 5.PIN1-shRNA转染Hep-2细胞检测细胞凋亡情况。
　　 6.应用MTT方法检测PIN1-shRNA转染Hep-2细胞后细胞的增殖能力的改变。
　　 7.免疫荧光法检测细胞转染后中心体的扩增情况。
　　 8.应用Transwell检测PIN1-ShRNA转染Hep-2细胞后细胞迁移能力的改变。
　　 实验结果:
　　 1.成功构建PIN1基因的重组载体。
　　 2.RT-PCR结果显示,喉癌组织PIN1的mRNA水平明显高于癌旁组织,Hep-2细胞中PIN1的mRNA水平明显高于HEK293细胞。
　　 3.RT-PCR和Westernblot灰度比半定量检测结果显示,特异性PIN1-shRNA转染Hep-2细胞72h后mRNA和蛋白水平与对照组相比明显降低。
　　 4.PIN1shRNA转染Hep-2细胞后与对照组相比,实验组喉癌Hep-2细胞的增殖能力和体外侵袭能力显著降低、细胞凋亡率增加。
　　 5.中心体异常统计结果:Hep-2细胞系有明显的中心体扩增,经统计中心体数目变化范围为1～7个,PIN1-shRNA转染Hep-2细胞后,有中心体异常的细胞数目(即中心体数目＞2)为0～1%明显低于对照组的10～22%(p＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.与癌旁正常组织和HEK293细胞系相比较,PIN1基因在喉癌组织中以及Hep-2细胞系中高表达,揭示其可能参与喉癌发生发展。
　　 2.喉癌细胞中中心体扩增显著,可能是喉癌发生的原因之一。
　　 3.PIN1特异性shRNA重组质粒转染喉癌Hep-2细胞可有效干扰PIN1基因的表达,并能显著的抑制Hep-2细胞增殖能力、侵袭能力以及中心体扩增。