姜黄素对饮水砷暴露小鼠肝脏损伤及对肝脏Nrf2信号通路的影响

摘要

目的:
　　 砷是国际癌症研究组织(IARC)确认的人类致癌物。砷在体内的代谢过程是一种甲基化代谢反应。主要通过氧化还原和一甲基化、二甲基化过程,最终转化为多种甲基化的砷代谢产物,随尿液排出。肝脏是砷代谢、毒性和致癌性的主要靶器官。氧化应激是慢性砷中毒的主要作用机制之一。无机砷暴露产生活性氧群(rROS)、并且影响体内许多重要的抗氧化酶的活性和GSH等抗氧化物的大量耗竭。为避免ROS的损害或肝脏纤维化,肝脏具有一系列复杂的抗氧化防御系统。其中最主要的目前被认为是Nrf2信号通路。该通路最终通过调控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的转录,包括血红素单加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)、醌氧化还原酶(NQO1)、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transfcrase,GST)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLcandGCLm)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、和环氧化物水解酶(epoxidehydrolase,EH)等,能够降低肝脏对氧化应激的敏感性,从而保持肝脏功能的稳定以及阻止肝脏疾病的发生。
　　 姜黄素(curcumin)是从姜黄根茎中提取的一种酚类化合物,具有抗炎、抗氧化等多种广泛的生物学作用,因此其对机体的抗氧化保护作用和机制一直受到普遍关注。姜黄素通过多种机制发挥其保护作用,其中之一是促进细胞的核转录因子Nrf2发生核转位,进而活化并诱导Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶,从而发挥对氧化应激的保护作用。目前,有关姜黄素对于砷诱导的肝脏损伤的保护作用的整体动物实验、以及姜黄素在整体动物中对肝脏Nrf2信号通路的影响,报道尚不多见。
　　 综上所述,本研究拟采用小鼠整体动物实验模型,观察姜黄素干预对饮水砷暴露小鼠肝脏损伤的保护效果、并初步探讨姜黄素对肝脏Nrf2信号通路的可能影响。本研究试图为使用膳食化合物活化Nrf2信号途径来对抗或缓解砷诱导的慢性损伤等的可能性和可行性等提供实验依据。
　　 实验方法:
　　 1、实验动物及分组选择健康昆明种雌性小鼠60只,分组情况如下:对照组(control)蒸馏水,单纯染毒组10mg/L、50mg/L,100mg/LNaAsO2200mg/kg姜黄素干预组200mg/kg姜黄素+10mg/L、50mg/L,100mg/LNaAsO2600mg/kg姜黄素干预组600mg/kg姜黄素+10mg/L、50mg/L,100mg/LNaAsO2
　　 2、染毒小鼠一般状况观察
　　 3、测定血清ALT和AST活力:南京建成试剂盒
　　 4、测定肝脏MDA含量:南京建成试剂盒
　　 5、测定全血GSH含量及肝脏GSH活力:DTNB法
　　 6、肝脏GSH-Px活力测定:南京建成试剂盒
　　 7、肝脏Nrf2、H0-1和NQO1的蛋白表达水平:westernblot方法分析
　　 8、肝脏病理形态观察和免疫组化
　　 9、饮水砷暴露小鼠的尿砷含量测定
　　 实验结果:
　　 1、一般情况
　　 所有的60只小鼠用NaAsO2处理6周均存活。不同水砷浓度不同组别小鼠体重、饮水量和肝脏脏器系数间均无明显差异。
　　 2、姜黄素干预对饮水砷暴露小鼠肝脏损伤的影响
　　 10mg/L、50mg/L和100mg/LNaAsO2单纯染毒组小鼠与对照组小鼠相比,血清ALT和AST活力均显著升高(p<0.01);姜黄素干预组小鼠与单纯染毒组小鼠相比,血清中ALT和AST活力显著下降(p<0.01)。10mg/L、50mg/L和100mg/LNaAsO2单纯染毒组小鼠与对照组小鼠相比肝脏MDA含量显著增高(p<0.01);姜黄素干预组小鼠与单纯染毒小鼠相比与肝脏MDA含量显著降低(p<0.01)。50mg/L和100mg/LNaAsO2单纯染毒组小鼠与对照组小鼠相比全血和肝脏GSH含量均显著降低(p<0.01);姜黄素干预组小鼠与单纯染毒组小鼠相比,全血和肝脏GSH含量均显著升高,差异具有显著性(p<0.01)。
　　 3、姜黄素干预对饮水砷暴露小鼠肝脏Nrf2信号通路的影响
　　 10mg/L、50mg/L和100mg/LNaAsO2单纯染毒组小鼠的肝脏Nrf2蛋白表达与对照组相比有所增高;姜黄素干预组与单纯染毒组相比,肝脏中Nrf2蛋白表达均显著增高。10mg/L、50mg/L和100mg/LNaAsO2单纯染毒组小鼠,肝脏NQO1蛋白表达随染毒剂量增高而明显下降;姜黄素干预组与单纯染毒组相比,肝脏中NQO1蛋白表达均显著增高。10mg/L和50mg/LNaAsO2单纯染毒组小鼠与对照组小鼠相比肝脏HO-1蛋白表达有所增高,而100mg/LNaAsO2单纯染毒组的肝脏HO-1蛋白表达则显著降低;姜黄素干预组与单纯染毒组相比,肝脏中HO-1蛋白表达均显著增高。
　　 10mg/L、50mg/L和100mg/LNaAsO2单纯染毒组小鼠与对照组相比,肝脏的胞浆和胞核中的Nrf2均有所增高,姜黄素干预组与单纯染毒组相比,肝脏胞浆和胞核中的棕褐色抗Nrf2的阳性颗粒均显著增多,且Nrf2的细胞核转位非常明显。
　　 4、姜黄素干预对饮水砷暴露小鼠尿砷含量的影响
　　 姜黄素干预组与单纯染毒组相比,尿T-As含量、DMA含量和DMA%显著增高,而iAs含量和iAs%显著降低,以及甲基化率PMI和SMI的显著增高。
　　 结论:
　　 1、姜黄素对饮水砷暴露小鼠的肝脏毒性和氧化损伤具有一定的拮抗作用。
　　 2、姜黄素能够诱导饮水砷暴露小鼠肝脏Nrf2的核转位和活化、并进一步激活Nrf2下游信号通路。
　　 3、姜黄素能够促进饮水砷暴露小鼠体内的砷甲基化代谢和排泄。