肿瘤坏死因子Ⅰ、Ⅱ型受体及膜结合型TNF-α在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖机制中的作用

摘要

目的:
　　1、首先在不同浓度外源性TNF-α的刺激下，在不同浓度、不同培养时间点上，观察体外培养的RA患者FLS的增殖情况，检测TNF-RⅠ、TNF-RⅡ、mTNF-α、NF-κ B1(P50)、 NF-κ B2(P52)及下游因子IL-2、IL-6、IL-8的蛋白水平(Western-blot)及mRNA(RT-PCR)变化。从而明确在FLS增殖中，TNF-RⅠ、TNF-RⅡ、mTNF-α的动态变化。
　　2、再以siRNA技术分别敲TNF-RⅠ、TNF-RⅡ，再以TNF-α刺激FLS，检测TNF-RⅠ、TNF-RⅡ、mTNF-α、NF-κ B1(P50)、NF-κ B2(P52)及caspase8、caspase3的蛋白水平（Western-blot）及mRNA(RT-PCR)变化。探讨在TNF-α促FLS增殖作用中，TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及mTNF-α分别起什么作用。
　　3、然后在TNF-α刺激RA FLS后分别加入TNF-α单克隆抗体（Infilixmab，A药）、TNF-RⅡ拮抗剂（Etanercept，B药）及同时加入A药和B药，检测TNF-RⅠ、TNF-RⅡ、mTNF-α、蛋白水平(Western-blot)及mRNA(RT-PCR)变化。探讨Infilixmab和Etanercept分别应用及合并应用时对FLS的抑制作用。
　　方法:
　　1、原代细胞培养:取无菌手术组织剪碎后放入培养瓶中，经EDTA胰酶消化和10％血清的1640培养基培养。FLS传代次数约3代～7代备用。
　　2、RA FLS增殖实验，TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及mTNF-α表达:最佳刺激浓度:将TNF-α配置到培养基中，终浓度分别为1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml及40ng/ml6个浓度梯度，外加无TNF-α的培养基共7个浓度，每个浓度3个孔共计21孔。孔板分别培养6h、12h、24h、48h及72h后测定MTT。以Biorad酶标仪450nm检测吸光度值，分别检测上述时间点的吸光度值，然后根据数值做增殖曲线。最佳TNF-α刺激时间:将FLS种植到6孔板中，每孔给予20ng/ml TNF-α处理，分别作用0、1、6、12、24、48小时后使用细胞刮刀收集细胞，以备做Western Blot和PCR检测mTNF-α、TNF-RⅡ、TNF-RⅠ的蛋白及mRNA的变化。免疫荧光实验:24孔板放入切碎的盖玻片，FLS传代加入孔板中，然后按时间点加入TNF-α(cell signa ling公司)刺激RA FLS24小时，用4％多聚甲醛固定，PBS冲洗，使用10％正常山羊血清封闭，加入TNF-α一抗（1∶200配在PBS中），加入荧光二抗(1∶300，invitro gen公司alexa flur488基团)。
　　3、敲除TNF-RⅠ、TNF-RⅡ对RA FLS NF-κ B和凋亡相关蛋白的影响，使用Dharmacon专用siRNA。siRNA敲除效果的验证:将RA FLS铺到6孔板中，细胞密度达到70％时转染Negative control siRNA，siTNFR1或siTNFR2。下游变化检测:以siRNA分别敲除TNF-RⅠ、TNF-RⅡ，以TNF-α最适浓度、最适时间刺激RA FLS后，测定:1)检测mTNF-α表达，2）Western Blot检测caspase3/cleaved C3、caspase8/C8及P50/P52，3）PCR检测下游靶基因IL-2、IL-6、IL-8表达。免疫荧光实验:24孔板放入切碎的盖玻片，RA FLS传代加入孔板中，然后按时间点加入TNF-α（cell signa ling公司）刺激si TNF-RⅠ或si TNF-RⅡ FLS24h，用4％多聚甲醛固定，PBS冲洗，使用10％正常山羊血清封闭，加入TNF-α一抗（1∶200配在PBS中），加入荧光二抗（1∶300，invitrogen公司alexaflur488基团）。
　　4、英夫利昔单抗(Infliximab，A药)和依那西普(Etanercept,B药)对RA FLS增殖抑制实验。浓度梯度测定:将RA FLS铺到6孔板中，细胞密度达到80％时加入20ng/ml TNF刺激24h撤药，给予A药、B药、A+B药处理及一组未加药处理组加药12h（浓度0、1、2.5、5、10、15、20μg/ml）后将细胞消化离心收集蛋白，收集细胞供下游Western blot及PCR检测使用。最佳时间测定:将RA FLS种植到6孔板中，给予20ng/ml TNF-α处理24h后分别给予A药、B药、A+B药处理(浓度10μg/ml)及一组未加药处理组加药6、12、24h后收集细胞以备PCR检测下游指标的变化。
　　结果:
　　1、RA FLS增殖实验，TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及mTNF-α表达。TNF-α刺激并不能加速OA FLS增殖。TNF-α在10ng/ml浓度以上时对RA FLS增殖的刺激作用明显（10ng/ml与5ng/ml: P＜0.01，24h），而10ng/ml与20ng/ml、40ng/ml之间差异不明显(P＞0.05)。在以下实验中我们选择10～40之间的中位浓度20ng/ml对细胞进行刺激。Western Blot结果发现TNF-α在24h上调明显，TNF-RⅠ出现下调，TNF-RⅡ出现上调。PCR结果发现:TNF-RⅠ下调，TNF-RⅡ上调，24h明显。TNF-α:6h TNF-α上调。IL-2:6h开始上调，24h明显; IL-6、IL-8:12h开始上调，24h明显。
　　2、TNF-RⅠ、TNF-RⅡ敲除对RA FLS NF-κ B和凋亡相关蛋白的影响。Western Blot:敲除TNF-RⅠ后，TNF-RⅡ、TNF-α、caspase3及caspase8蛋白水平均下降;敲除TNF-RⅡ后，TNF-RⅠ、TNF-α、caspase3及caspase8蛋白水平下降不明显。RT-PCR:敲除TNF-RⅠ后，TNF-RⅡ、TNF-α、IL-2、IL-6及IL-8 mRNA水平均明显下降;敲除TNF-RⅡ后，TNF-RⅠ、TNF-α、IL-2、IL-6及IL-8 mRNA水平下降不明显。
　　3、A药、B药对FLS增殖抑制实验。A、B药浓度梯度:Western Blot结果:随着A药、B药及A+B药浓度递增，RA FLS的TNF-α表达逐渐递减，对TNF-RⅠ无明显影响，但B药对TNF-RⅡ有明显影响(0μ g/ml/20μ g/ml)。当浓度＞5μg/ml时TNF-α表达明显减少。A药、B药、A+B药相互间无明显区别。RT-PCR(药浓度梯度12h)结果:随着A药、B药及A+B药浓度递增，RA FLS的TNF-α表达逐渐递减，对TNF-RⅠ无明显影响，但B药对TNF-RⅡ有明显影响(0μ g/ml/20μg/ml)。当浓度＞5μ g/ml时TNF-α表达明显减少，A药、B药、A+B药相互间无明显区别。A药、B药、A+B药不同时间点下游IL-6，IL-8表达:分别给予A药、B药、A+B药处理(浓度10μ g/ml)及一组未加药处理组加药6、12、24h后收集细胞以备PCR检测下游指标的变化。结果:随着作用时间延长，IL-6，IL-8表达逐渐减少。24h时TNF-RⅡ表达明显减少。
　　结论:
　　1、TNF-RⅠ基本为组成性表达，主要起促炎作用，尤其是在RA FLS炎性反应的早期时相。炎性因子mTNF-α、IL-2、IL-6及IL-8等的表达主要与TNF-RⅠ有关。TNF-RⅠ可同时传导活化(NF-κ B)和凋亡信号。
　　2、TNF-RⅡ的表达受TNF-RⅠ调控。但mTNF-α的表达在时相上早于TNF-RⅡ，所以TNF-RⅡ的表达亦可能受mTNF-α调控。以外源性TNF-α刺激RA FLS后，再加入生物制剂TNF-RⅡ出现下调，提示TNF-RⅡ为诱导性表达。TNF-RⅡ上调后，激活NF-κ B，但所诱导的目的基因产物究竟为促炎产物亦或为抑炎产物，有待于进一步研究。
　　3、TNF-RⅠ、TNF-RⅡ可同时经经典和非经典两个途径活化NF-κB。
　　4、mTNF-α传递的逆向信号在RA FLS发病中起促炎作用，mTNF-α传递的正向信号是促使TNF-RⅡ表达下降或增加的关键因素。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及mTNF-α表达

1 前言

2．1 材料

2．2 方法步骤

3．1 RA FLS的形态学观察

3．3 TNF-α对RA FLS的刺激

3．4 最佳TNF-α刺激时间

3．5 TNF-α免疫荧光

4 讨论

5 结论

第二部分：TNF-RⅠ、TNF-RⅡ工敲除对FLS NF-κB、凋亡相关蛋白及相关炎性因子的影响

1 前言

2．1 材料

2．2 方法步骤

3 实验结果

3．2 TNF-RⅠ、TNF-RⅡ敲除对FLs TNF-α、IL-2、IL-6及IL-8mRNA检测结果

3．3 免疫荧光

4 讨论

5 结论

第三部分：Infliximab和Etanercept对RA FLS抑制实验

1 前言

2．1 材料

2．2 方法步骤

3．1 A、B药浓度梯度

3．2 A药、B药、A+B药时间点

3．3 A药、B药、A+B药不同时间点下游IL-6，IL-8表达

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 尘肿瘤坏死因子Ⅰ、Ⅱ型受体及膜结合型TNF-α在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖机制中的作用

攻读学位期间取得的研究成果

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