普罗布考、西洛他唑对大鼠骨髓源性内皮祖细胞功能活性影响的研究

摘要

目的：随着研究的进展，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的治疗已经取得显著成效，单独使用抗氧化、调脂及抗血小板治疗已取得了良好效果，尤其是普罗布考（Probucol，丙丁酚）和西洛他唑(Cilotazol)为应用广泛的抗动脉粥样硬化药物，临床主要用于改善慢性动脉闭塞症引起的缺血性症状如溃疡及间歇性跛行等。两药在抗动脉粥样硬化、防治血管形成术后再狭窄等心血管疾病的治疗方面已经越来越引起人们的广泛关注，其新的作用机制及应用正在被进一步认识。
　　 内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是成熟血管内皮细胞的前体细胞，存在于体内多种组织。其中骨髓含量最为丰富，其能够迁移并定向分化为成熟的血管内皮细胞。实验表明，EPCs不仅参与了胚胎时期原始血管网的形成，还参与了出生后血管的修复与新生。临床前研究也证明EPCs能够治疗肢体缺血，心肌梗死等缺血性疾病，提示EPCs在治疗AS中的潜在作用，并逐渐引起了人们的重视。
　　 由于人体中EPCs含量较少，含量最丰富的骨髓中也仅占骨髓单个核细胞的1％。因此，在如AS等血管损伤性疾病的治疗过程中，选择恰当的治疗手段，以提高EPCs含量和功能活性，来保证EPCs更加有效地实现血管损伤修复是本实验的研究重点。普罗布考和西洛他唑现已广泛应用于临床，是有效抗动脉粥样硬化药物，能够作用于多种细胞，尤其是血管内皮细胞，发挥其降脂、抗炎、抗氧化等作用，保护内皮细胞的结构和功能的完整性，对于阻止缺血性疾病的发生发展具有重要意义。然而目前，有关普罗布考和西洛他唑对内皮祖细胞功能活性影响的研究报道很少。本实验研究的主要目的是探讨普罗布考和西洛他唑对大鼠骨髓源性内皮祖细胞功能活性的影响，阐明普罗布考和西洛他唑影响下的内皮祖细胞介导的血管新生作用的潜在机制，从而为AS等缺血性疾病的治疗和新药的开发提供实验依据。
　　 方法：
　　 一、大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离及培养150-200gWistar大鼠购自中国医科大学实验动物部。采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离单个核细胞，用含有10％胎牛血清的EGM-2MV内皮祖细胞培养液进行原代培养，置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱中孵育。隔天换液一次，7-9天细胞呈单层密集生长。实验所用细胞为培养7天左右的原代细胞。
　　 二、大鼠骨髓源性内皮祖细胞的鉴定（一）形态学观察:倒置显微镜下观察细胞形态及生长特性。
　　 （二）TRICT-CD133和FITC-vWF双重免疫荧光鉴定取培养第五天的细胞进行检测。一抗为山羊抗大鼠CD133和兔抗大鼠vWF单克隆抗体，二抗分别为TRICT标记的驴抗山羊和FITC标记的羊抗兔IgG。
　　 三、实验分组
　　 分为对照组、普罗布考浓度组和西洛他唑浓度组。普罗布考浓度分别为0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L，西洛他唑浓度分别为0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L。
　　 四、内皮祖细胞增殖活性的检测消化收集贴壁细胞，以1×104个/孔的细胞数接种于96孔板中，培养7天后以药物作用24小时，采用MTT法检测细胞的增殖，置酶联免疫检测仪检测OD490值。
　　 五、内皮祖细胞管腔形成的检测4℃溶解Matrigel胶，将其加入24孔培养板中，孵箱孵育30min，将细胞悬液按1×104个/孔的细胞数接种于铺满Matrigel胶的24孔板上。以药物作用24小时后，观察各组细胞的管状结构排列情况和完整程度，随机选取管腔密集的视野处计数并拍照。
　　 六、Real time RT-PCR检测CD133和vWF mRNA表达水平收集药物作用24小时后的EPCs，进行RNA抽提，反转录后在荧光定量PCR仪上进行扩增，最后计算mRNA的相对表达量，每次实验每个样本设3个复孔。
　　 七、统计学处理实验数据采用SPSS17.0统计分析软件进行单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。
　　 结果：
　　 一、EPCs的培养与鉴定原代培养24h后，细胞大部分呈小圆形;差速贴壁筛选后，培养1d可见少量细胞贴壁;4d后细胞开始伸展成梭形或纺锤形;7d后集落中央为圆形细胞，外周细胞呈梭形，且生长旺盛;大约10d至14d融合成单层，呈内皮细胞典型的铺路石样形态。CD133、vWF标记培养第五天的EPCs，可见双荧光阳性，表明其为正在分化的EPCs。
　　 二、普罗布考及西洛他唑对EPCs增殖的影响在培养的EPCs中分别加入不同浓度的普罗布考（0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L）或西洛他唑（0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L），作用24小时，MTT法检测结果表明，与对照组相比，不同浓度的普罗布考或西洛他唑均可以促进EPCs的增殖，P值＜0.05。
　　 三、普罗布考及西洛他唑对EPCs管腔形成的影响在培养EPCs中分别加入不同浓度的普罗布考（0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L）或西洛他唑（0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L），作用24小时，Matrigel管腔形成检测结果表明，与对照组相比，不同浓度的普罗布考或西洛他唑均可以促进EPCs的管腔形成，P值＜0.05。
　　 四、普罗布考及西洛他唑对EPCs分化的影响在培养EPCs中分别加入不同浓度的普罗布考（0.3μmol/L、1.0μmol/L、3.0μmol/L、10.0μmol/L）或西洛他唑（0.1μmol/L、0.3μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L），作用24小时，采用实时定量PCR法检测EPCs表面抗原CD133和vWF的表达情况。结果表明，与对照组相比，CD133表达减弱，vWF表达增加，P值＜0.05。
　　 结论：
　　 1、普罗布考可以促进培养大鼠骨髓源性内皮祖细胞的增殖、管腔形成及分化能力。
　　 2、西洛他唑可以促进培养大鼠骨髓源性内皮祖细胞的增殖、管腔形成及分化能力。

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