高糖对大鼠DRG中TRPV4通道的影响

摘要

痛性糖尿病周围神经病变(painful diabetic neuropathy，PDN)是逐渐被认识的糖尿病最常见的并发症之一。PDN的主要临床症状是自发性疼痛、痛觉过敏、上下肢对称性疼痛等神经病理性疼痛，患者可能出现剧烈的肢体疼痛，还伴随睡眠障碍及抑郁，甚至导致足部溃疡或截肢，严重影响患者的生活质量，同时也是糖尿病患者致死致残的主要因素。因为感觉异常往往是PDN的首发症状，背根神经节(DRG)富含感觉神经元，代谢水平高，自主调控时对局部血流变化非常敏感，在解剖学上不受血脑屏障和血神经屏障的保护，所以DRG神经元在糖尿病状态下有明显的易感性。已有许多的研究报告表明在链脲霉素引起的糖尿病大鼠DRG神经元或培养的糖尿病大鼠DRG神经元存在神经元凋亡。TRPV4通道在DRG神经元上高表达，并且在DRG神经元受到持续压迫后机体产生各种伤害性感觉及神经性疼痛的传导过程中发挥着关键的作用，TRPV4通道被激活后可导致Ca2+内流，使神经元内钙超载。但是TRPV4通道是否参与了PDN的形成尚未有报道。蛋白激酶Cε(protein kinase Cε，PKCε)是TRPV4的刺激因子之一，是细胞内信号转导重要物质，在糖尿病状态下DAG代谢量增多，PKCε进而被激活。所以本实验在细胞水平研究高糖对DRG神经元上TRPV4通道的影响，明确葡萄糖/DAG-PKCε/TRPV4、Ca2+在PDN形成及发展过程中是如何发挥作用的。
　　 材料与方法
　　 原代培养的新生大鼠DRG神经元，不同糖浓度处理24 h、48 h、72 h，采用MTT法和LDH试剂盒检测DRG神经元的生存率和LDH的生成量。不同糖浓度组分别设为空白组和Enzasturin处理24 h组，用ELISA方法检测DRG神经元内的DAG含量。不同糖浓度组的DRG神经元，采用全细胞膜片钳检测TRPV4通道的电流密度及其电流密度的改变，采用共聚焦显微镜检测DRG神经元内的游离钙离子含量及其改变。
　　 结果
　　 1、不同葡萄糖浓度对DRG神经元生存率和LDH生成的影响
　　 葡萄糖浓度5.5、11.0、17.5、25.0、35.0、50.0(mM)培养DRG神经元24 h、48 h、72 h，随葡萄糖浓度的增高，DRG神经元相对生存率降低，LDH的生成增多，同时表现为时间和剂量依赖性。根据MTT和LDH的结果最终确定，培养DRG神经元的葡萄糖浓度分别为C组:5.5mM、M组:17.5 mM、H组:35.0 mM，培养时间为48 h。DRG神经元培养48 h后，在糖浓度为17.5 mM和35.0 mM时，神经元生存率(％)分别为0.87±0.06和0.73±0.07，LDH的生成量分别为181.00±18.86和233.33±23.08。在细胞形态上，DRG神经元在生长过程中贴壁不良，边缘不清晰等现象，使DRG神经元失去正常生长状态。
　　 2、DRG神经元内DAG含量的检测
　　 空白组与给药组中，不同葡萄糖浓度培养后与C组相比，M组和H组DAG的含量增加，H组更显著(P＜0.01)。在葡萄糖浓度相同时，DAG含量的空白组低于给药组(P＜0.05)。
　　 3、激光共聚焦显微镜检测DRG神经元内[Ca2+]i
　　 记录到不同糖浓度下DRG神经元内钙离子浓度，分别为(nM)C:161.53±5.47、M:191.53±4.01、H:282.21±8.64。TRPV4通道的激动剂4α-PDD可以浓度依赖性地引起[Ca2+]i增加，去除溶液中的钙，细胞对4α-PDD的反应丧失。与C组相比，4α-PDD引起的M组和H组钙浓度升高的幅度和峰值明显增加(P＜0.01)。Enzastaurin可以显著降低DRG神经元内钙离子浓度，抑制率(％)分别为C:47.51、M:57.04、H:60.70。然而，在先给予Enzastaurin后，DRG神经元内[Ca2+]i水平基本没有改变，进一步给4α-PDD，DRG神经元内[Ca2+]i水平升高的幅度显著变小，甚至出现下降。
　　 4、DRG神经元TRPV4通道电流的检测
　　 DRG神经元的电容(pF)，C组:21.04±2.19;M组:23.70±2.37;H组:25.71土3.34。
　　 ITRPV4(pA/pF),C组，-100 mV:-3.38±0.74,+100mV:5.99±0.68;M组，-100mV:-8.63±1.3,+100mV:10.82±0.88;H组，-100 mV:-9.27±2.16,+100 mV:12.29±1.77。M组和H组较C组的TRPV4通道的电流密度显著升高(P＜0.05)。
　　 TRPV4通道激动剂可以使M组、H组ITRPV4显著增强，激活率分别为(％)C:185.59、M:202.67、H:312.60。然而TRPV4通道激活后产生的电流又可以被PKCε特异性抑制剂Enzastaurin所抑制，抑制率(％)分别为C:14.61、M:27.40、H:42.90;PKCε特异性抑制剂Enzastaurin可以抑制ITRPV4，但是不能被TRPV4通道激动剂重新激活。
　　 结论：
　　 1、高糖使TRPV4通道功能增强，导致DRG神经元内[Ca2+]i升高。
　　 2、DRG神经元内[Ca2+]i的升高是由TRPV4通道介导的，TRPV4通道的活性依赖于PKCε的激活，而PKCε又受到DAG的调控。
　　 3、PDN的形成机制可能与以下因素有关，即神经元内过多的葡萄糖引起DAG合成增加，导致神经元内DAG含量升高，进而激活PKCε，并且协助PKCε由胞浆转移到细胞膜，进而调节和激活TRPV4通道，导致DRG神经元钙离子内流，引起神经痛。

目录

声明

摘要

二、英文缩略语

三、论文

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

四、本研究的创新性自我评价

参考文献

六、附录

综述

在学期间科研成绩

致谢

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