HIV-1劣势耐药突变对艾滋病患者二线治疗效果影响的研究

摘要

目的:
　　 艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)是由艾滋病病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的一种传染病，尚无法治愈。高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，HAART)是目前治疗艾滋病最有效的方法。治疗后一些患者产生了耐药，成为影响抗病毒治疗效果的最主要原因。
　　 HIV-1基因型耐药检测方法因其检测快速、方便、成本低而受到广泛应用，但是这种方法检测不到占HIV-1准种20％以下的劣势耐药突变。在特异的药物选择压力下，有劣势耐药突变的病毒复制能力高于野生型病毒，会持续低水平复制并最终进化为优势病毒，加速耐药的产生的抗病毒治疗的失败，研究HIV-1劣势耐药突变能更好地指导艾滋病病人合理用药。目前，国外关于HIV-1劣势耐药突变对治疗效果的影响具有争议。在我国关于劣势耐药突变的研究较少，仅限于方法学的讨论以及个别劣势耐药突变的检测，关于HIV-1劣势耐药突变对于治疗效果的影响还未见报道。
　　 我国于2003年开始施行免费抗病毒治疗。到2011年底，我国艾滋病感染者有15万人接受了免费抗病毒治疗。在抗病毒治疗后，很多病人体内的病毒未被有效抑制，耐药率也随治疗时间的延长逐年增加。越来越多的患者一线抗病毒治疗失败需要更换二线治疗方案。
　　 在我国主要应用in-house基因型耐药检测方法，这种方法检测不到占HIV-1准种20％以下的劣势耐药突变。一线抗病毒治疗失败后病人劣势耐药突变情况如何？如果更换二线药前有针对药物的劣势耐药突变是否会影响其效果？为回答上述问题，本研究对我国河南地区一线治疗失败后更换二线药物方案治疗前的艾滋病感染者进行HIV-1劣势耐药突变检测，探讨HIV-1劣势耐药突变对二线治疗效果的影响，从而为我国HIV-1耐药检测方法的选择、优化提供理论依据。
　　 方法:
　　 1、研究对象
　　 参照2007版《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》中艾滋病病人二线方案入选标准，在我国河南省尉氏县于2009年8月、2010年1月招募195名患者。对于符合二线方案入选标准的患者，根据其二线抗病毒治疗18-24个月后病毒载量结果分为病毒抑制组与病毒未抑制组。在两组人群中，根据换药前病人CD4、VL、年龄、性别、依从性等相匹配的原则挑取23名患者。病毒未抑制11人，病毒载量5066-896965 copies/ml。病毒抑制12人，病毒载量0-396copies/ml。所有患者签署了知情同意书，二线抗病毒治疗方案均使用WHO推荐的拉米夫定(3TC)+替诺福韦(TDF)和诺匹那韦+利托那韦(克立芝，LPV/r)。
　　 病毒未抑制:经HAART后血浆中病毒载量＞400 copies/ml。
　　 病毒抑制:经HAART后血浆中病毒载量＜400 copies/ml。
　　 2、CD4+T淋巴细胞测定
　　 20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，用FACS MMLTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。
　　 3、病毒载量测定
　　 以1ml血浆采用Roche公司COBAS TaqMan自动载量仪检测病毒载量。
　　 4、病毒核酸提取
　　 以抗凝140μl血浆提取病毒基因组RNA，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书步骤提取RNA，提取物溶于60μl洗脱液中。
　　 5、巢氏聚合酶链反应(nest-PCR)
　　 以外侧引物对:MAW26(5'-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’;HXB22028-2050)和RT21(5’-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3’; HXB23509-3539);内侧引物对:PRO-1(5’-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’;HXB23509-3539)和RT4R(5’-CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT-3’;HXB23509-3539)，用于扩增HIV-I pol序列。
　　 6、PCR反应产物纯化
　　 取产物45μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，经Ultra-Violet Product凝胶成像后与marker比对，确认所需片段，用QIAquik Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。
　　 7、TA克隆
　　 扩增的pol基因片段插入克隆载体pMD18T-vector，转入化学感受态菌DH5a扩大培养，然后提取质粒DNA测序
　　 8、序列分析
　　 克隆获得的序列用Sequncher软件进行拼接，用BioEdit软件进行序列比对。用MEGA5.0软件的进行系统树分析，登录美国斯坦福大学HIV耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu)在线进行HIV耐药突变情况和耐药性分析。
　　 9、统计学分析
　　 用SPSS16统计软件进行统计分析;数据使用四分位间距;基线两组的比较用Fisher检验或非参数检验。Fisher检验分析劣势耐药突变与病毒学效果的关系;p＜0.05为有统计学意义。
　　 结果:
　　 一、换药前研究对象基本资料
　　 （一）基本人口学信息
　　 本研究23例病人，应用统一二线方案3TC+ TDF+LPV/r进行治疗。病毒未抑制组11人，病毒抑制组12人。换药前病毒未抑制组病毒载量(log)为5.179(4.474-5.524)、CD4计数为137(20-281)、年龄47(42-55)、男性7人、女性4人。换药前病毒抑制组病毒载量(log)为5.316(4.898-5.636)、CD4计数为164(94-333)、年龄45.5(39.5-53.3)、男性7人、女性5人。一线治疗方案包括AZT+DDI+NVP、AZT+3TC+NVP、D4T+DDI+NVP,两组一线治疗方案构成和病毒载量、CD4计数、年龄、性别没有统计学差异，具有可比性。
　　 （二）换药前in-house基因型耐药检测结果
　　 23名患者均未检测到蛋白酶抑制剂(PI)主要耐药突变，对所有的PI敏感。病毒未抑制组11人中耐药的有7人，病毒抑制组12人中耐药的9人，无统计学差异(P＞0.05)。病毒未抑制组4人对核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)耐药，7人对非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)耐药。病毒抑制组对NRTI和NNRTI耐药人数为8和9。病毒未抑制组的NRTI和NNRTI耐药突变的数量和种类均少于病毒抑制组。
　　 在换药前，有一部分患者对二线方案中的3TC和TDF产生了交叉耐药。病毒未抑制组对3TC、TDF耐药人数少于病毒抑制组，对3TC和TDF的耐药评分值比病毒抑制组低。病毒未抑制组对3TC和TDF耐药的人数为2、3，病毒抑制组为7、8。
　　 （三）应用二线治疗方案后服药依从性
　　 在服用二线治疗药物后，每年用调查随访表评估所有患者的服药依从性。病毒抑制组与病毒未抑制组所有人按时服药比例在95％以上，依从性较好。
　　 二、换药前HIV-1劣势耐药突变检测情况及劣势耐药突变对二线治疗效果的影响
　　 （一）HIV-1劣势耐药突变检测情况
　　 除了in house检测到的耐药突变外，21人检测到了劣势耐药突变(in house均未检测到)，平均每个患者检测到了2-3个劣势耐药突变。
　　 In-house结果显示无耐药突变的有7人（病毒未抑制4人，病毒抑制3人），其中6人检测到了HIV-1劣势耐药突变。In-house检测到NRTI/NNRTI耐药突变的16人，15人检测到了劣势耐药突变，突变不同于in-house检测到的突变。
　　 除了NRTI/NNRTI劣势耐药突变外，我们还检测到了PI劣势主要耐药突变:V82A/L90M/I47V/I50V等。
　　 （二）HIV-1劣势耐药突变对治疗效果的影响
　　 对克隆测序耐药结果进行分析发现，病毒未抑制和抑制组耐药人数多于in-house检测结果，对二线方案中的3TC和TDF耐药人数也增加。In-house基因型检测结果显示对3TC和TDF敏感的人中检测到了3TC和TDF的劣势耐药突变。病毒未抑制组3人检测到了3TC劣势耐药突变，1人有TDF劣势耐药突变。病毒抑制组1人有3TC劣势耐药突变。
　　 病毒未抑制组6人有PI劣势主要耐药突变，病毒抑制组4人有PI劣势主要耐药突变。
　　 对两组的PI劣势主要耐药突变进行分析发现，病毒未抑制组5人含有的劣势主要耐药突变(V82A/I50V/I47V)对二线治疗方案中的LPV/r耐药。病毒抑制组虽然4人含有PI劣势耐药突变，但仅1人含有的突变(V82A)对LPV/r耐药，其余3人含有的PI劣势耐药突变对LPV/r潜在低度耐药或敏感。病毒未抑制组有LPV/r劣势耐药突变的人的比例(5/11)高于抑制组(1/12)。
　　 病毒未抑制组的1202和1126患者M46I突变占准种的比例较高。1202的M46I占24％，1126为10.3％。
　　 结论:
　　 1、一线治疗失败艾滋病患者存在HIV-1劣势耐药突变，NRTI/NNRTI劣势耐药突变与患者的一线治疗方案相关。
　　 2、换药前LPV/r劣势主要耐药突变可能影响二线治疗效果，在更换二线药前应对LPV/r劣势主要耐药突变进行检测，避免治疗失败。

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