RNAi沉默CypA基因对BGC-823胃癌细胞生物学行为的影响及其分子机制研究

摘要

目的：
　　胃癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一，在肿瘤中致死率居第二位。我国是胃癌高发国家，每年新发病例占全球的40％，我国多数胃癌患者在诊断时已属进展期并出现远处转移，预后较差，5年生存率仅20％左右。多数胃癌为分化程度不同的腺癌，因此多数胃癌病例具有对放化疗呈低度敏感甚至不敏感的特性。除手术完全切除外，目前胃癌的治疗尚无有效的“金标准”治疗方案，于是胃癌分子靶向治疗成为近年研究的热点，寻找新的有效的胃癌治疗靶点成为研究的关键。
　　亲环素A(CyclophilinA，CypA)是环孢素A(CyclosporinA，CsA)的胞内受体，在细胞的生命活动中起着重要的作用，并且参与多种疾病过程。近年来发现CypA在胃癌组织中表达升高，提示CypA有可能成为胃癌进展和治疗的靶分子之一。
　　研究目的是检测CypA在正常胃粘膜、胃癌及其癌前病变中的表达，分析其与胃癌临床病理因素的关系;检测CypA稳定沉默后对胃癌细胞体外生物学行为和裸鼠皮下成瘤的影响，并探讨其在胃癌发展和演进过程中的作用机制。
　　方法：
　　一、免疫组化方法检测CypA在胃癌及其癌前病变组织中的表达
　　搜集中国医科大学附属第一医院肿瘤外科手术切除胃癌标本132例，同时收集配对正常胃粘膜组织93例作为对照，慢性萎缩性胃炎(CAG)7例，肠上皮化生(IM)47例以及异型增生(Dys)22例，并搜集完备的临床病例资料。组织标本经常规组织蜡块制备之后行4um组织切片，HE染色，用于目标组织定位。采用组织芯片制作仪构建胃癌及癌前病变组织芯片蜡块，行4um连续切片。
　　采用PV-9000免疫组化方法检测正常胃粘膜、胃癌及其癌前病变中CypA蛋白的表达。兔抗人CypA多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，工作浓度1∶300，免疫组化试剂盒及DAB显色系统购自北京中杉生物有限公司。已知阳性组织玻片做阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。结果判定以免疫反应染色强度和阳性细胞所占同类细胞的百分比的乘积分为阴性（一）和阳性(+)两个等级。
　　将获得数据采用SPSS17.0统计学系统软件处理，免疫组化实验中CypA蛋白表达及其与胃癌的临床病理因素关系的分析采用行×列表的x2检验。检验水平P=0.05。
　　二、稳定沉默CypA的BGC-823胃癌细胞克隆的筛选及鉴定
　　常规培养正常胃粘膜细胞系GES-1，胃癌细胞系NCI-N87、MKN-45、SGC-7901、MGC-803和BGC-823。采用Real-Time和Western-Blot方法检测CypA在胃癌各细胞系中的表达，筛选出CypA异常高表达细胞系BGC-823胃癌细胞。设计合成四条CypA干扰片段，使用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ将载体pRNA U6.1/Neo双酶切使其线性化，将退火生成的shRNA片段连接入线性化的质粒载体的BamHⅠ和HindⅢ双酶切位点。连接产物转化DH5α感受态细胞并挑取阳性克隆。阳性克隆经PCR鉴定正确后，送与公司测序。将成功构建的质粒载体宿主菌扩大培养，抽提超纯质粒，转染BGC-823胃癌细胞。经G418抗性筛选60d后，获得CypA稳定沉默细胞克隆，并用Real-Time、Western-Blot和免疫荧光方法对CypA的干扰效率进行鉴定。
　　三、CypA沉默对BGC-823胃癌细胞体外生物学特性的影响及作用机制
　　采用流式细胞术进行细胞周期和凋亡检测，采用MTT法进行细胞增殖检测，采用克隆形成实验进行细胞克隆形成能力检测，采用划痕愈合实验和Transwell小室侵袭实验进行细胞迁移和侵袭能力的检测，以评估CypA稳定沉默后对BGC-823胃癌细胞体外生物学特性的影响。之后根据细胞学实验的结果又采用western-blot的方法检测了MAPK信号传导通路分子ERK1/2和p-ERK1/2、自噬相关分子P62和LC3、转移相关分子MMP9、p-Stat3等蛋白的表达变化，探讨CypA在BGC-823胃癌细胞中的作用机制。所获得的数据均使用SPSS17.0软件分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）的方法进行比较。显著性水平F=0.05。
　　四、CypA稳定沉默对BGC-823胃癌细胞裸鼠体内成瘤的影响及机制
　　购得上海斯莱克实验动物有限公司BALB/c-Nude裸鼠10只，周龄4-5周，雄性，体重18-20g左右。将裸鼠随机平均分成两组，分别取shV BGC-823和shCypABGC-823细胞悬液（5×106个细胞）于无菌条件下接种于裸鼠右肩皮下。然后每周定时测量裸鼠体重，并用游标卡尺测量瘤体的长短径，记录数据。接种30d后，将所有裸鼠处死，手术取出胃癌瘤体，称量重量。然后用Real-Time PCR方法检测皮下移植瘤瘤体组织中CypA mRNA的表达情况，用免疫组化方法检测CypA稳定干扰后胃癌瘤体组织中Ki67标记的增殖癌细胞的比率的变化。
　　结果：
　　1、胃癌组织中CypA蛋白的阳性表达率(69.7％，92/132)显著高于正常胃粘膜组织中的阳性率(22.6％，21/93)，P=0.000;在胃癌组织中CypA蛋白的阳性表达在BorrmannⅢ、Ⅳ型中的比例(73.0％)高于BorrmannⅠ、Ⅱ型(59.4％)，但是差异没有统计学意义;CypA蛋白在肠型胃癌(95.0％)中的表达显著高于弥漫型胃癌(55.6％)，P=0.000。
　　2、胃癌细胞系NCI-N87、MKN-45、SGC-7901、MGC-803、BGC-823中CypAmRNA的相对表达量分别是正常胃粘膜细胞系GES-1的0.67、1.36、1.57、1.62、1.86倍。除NCI-N87外，其它胃癌细胞系中CypA mRNA的相对表达量均高于GES-1细胞系，其中以BGC-823中的表达量最高。
　　3、成功构建了CypA稳定干扰载体，转染BGC-823胃癌细胞并获得了CypA稳定沉默克隆。
　　4、将BGC-823胃癌细胞中增高的CypA稳定沉默后，细胞的增殖能力和克隆形成能力明显下降，细胞周期阻滞在G0/G1期，但是并未见细胞凋亡的显著增加;BGC-823细胞的迁移和侵袭能力显著降低;p-ERK1/2蛋白的绝对量减少，p-ERK1/2与ERK1/2的比值减少;MMP9蛋白的表达量减少;自噬相关蛋白P62的表达量减少，LC3BⅡ型蛋白的表达量增多，并且LC3BⅠ型与LC3BⅠ型的比值增加;β-catenin蛋白和p-Stat3蛋白略有减少，NF-κB蛋白没有显著变化。
　　5、CypA稳定沉默后，BGC-823胃癌细胞的裸鼠皮下移植瘤成瘤速度显著减慢，瘤重显著低于对照组，瘤体中Ki67标记的增殖细胞的比率显著降低。
　　结论：
　　1、与正常胃粘膜上皮相比，CypA蛋白在胃癌组织和慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生等癌前期病变组织类型中的表达均显著异常增高;CypA蛋白在肠型胃癌中的表达显著高于弥漫型胃癌;CypA蛋白的阳性表达在胃癌组织BorrmannⅢ、Ⅳ型中的比例高于BorrmannⅠ、Ⅱ型，提示CypA参与了胃癌一的演进过程，有可能成为胃癌靶向治疗的分子标记。
　　2、CypA在除NCI-N87外的其他4种胃癌细胞系（MKN-45、SGC-7901、MGC-803、BGC-823胃癌细胞）中的表达水平普遍高于正常胃粘膜上皮细胞系GES-1，其中以BGC-823细胞中的表达量最高。我们成功构建了CypA的稳定RNA干扰载体，转染BGC-823胃癌细胞，并成功筛选出了高效沉默CypA的BGC-823胃癌细胞克隆shCypA BGC823。
　　3、稳定沉默CypA可能通过抑制ERK1/2信号转导通路活性，抑制MMP9蛋白的分泌及诱导癌细胞自噬，进而抑制BGC-823胃癌细胞的体外增殖和侵袭能力。
　　4、CypA稳定沉默后能抑制BGC-823胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，Ki67标记的增殖癌细胞的比率显著下调，提示CypA稳定沉默能抑制BGC-823胃癌细胞的体内增殖活性，有望成为胃癌治疗的一个新的分子靶点。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 CypA在胃癌及其癌前病变组织中的表达及l临床病理意义

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 稳定沉默CypA的BGC-823胃癌细胞克隆筛选及鉴定

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 CypA稳定沉默对BGC-823胃癌细胞体外生物学特性的影响及其作用机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文四 CypA稳定沉默对BGC-823胃癌细胞裸鼠体内成瘤的影响及机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 Cyclophilin A与肿瘤关系的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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