WNT4基因在子宫内膜异位症发生发展中的作用研究

摘要

目的:
　　子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)简称内异症，是子宫腔以外存在有功能的子宫内膜腺体和间质而引起的疾病，为育龄妇女的常见病，其发病率呈上升趋势，发病机制至今仍尚无定论。目前研究表明，内异症患者在位内膜细胞黏附、侵袭、血管形成能力增强，可能为内异症发病的源头[1]，但目前关于内异症发病的在位内膜特异性基因仍不明确。
　　WNT基因是高度保守的发育基因的大家族，是重要的细胞信号分子，WNT基因及其下游通路与细胞分化、增殖、凋亡、转移有关[2]，参与了各种疾病甚至肿瘤的发病过程[3.4]。WNT的功能与内异症的生物学行为有共同点，故WNT途径有可能与内异症发病有关，目前相关研究还很少。WNT4为WNT配体家族的一员，是一种局部作用的信号分子，参与细胞分化、增殖、转移等，与细胞凋亡有关[5]，WNT4本身在正常子宫内膜组织中表达，与子宫内膜的增殖、蜕膜化、着床等功能有关[6-8]，内异症为内膜性病变，当内膜中生理状态WNT基因表达发生改变时可能引起内异症的发生，本课题组前期对内异症在位内膜基因表达谱筛查结果发现内异症组在位内膜WNT4基因表达明显下调，由此我们推测，WNT4基因在在位内膜中的表达异常可能参与了内异症的发病，但需要大样本病例进行验证，此外，WNT4在内异症发病过程中如何发挥作用，是否通过调控细胞增殖、侵袭及凋亡而参与了内异症的发病还需要进一步研究。
　　方法:
　　一、WNT4在子宫内膜异位症异位病灶及在位内膜中的表达意义
　　1、应用荧光定量PCR(Real Time PCR)方法检测内异症异位病灶及在位内膜中WNT4 mRNA的表达水平;
　　2、应用免疫组化及蛋白免疫印迹技术(Western blotting)检测内异症异位病灶及在位内膜中WNT4蛋白表达。
　　二、WNT4基因在子宫内膜异位症在位内膜间质细胞(ESC)中的表达及对其生物学活性的影响作用
　　1、原代培养ESC及对照组在位内膜间质细胞(NSC)。
　　2、免疫细胞化学染色鉴定细胞。
　　3、构建pEGFP-N1-WNT4重组质粒转染ESC。
　　4、靶向NSC中WNT4基因的RNA干扰:构建3个WNT4 shRNA表达载体pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3。
　　5、Real time PCR检测转染WNT4基因重组质粒及WNT4 RNA干扰质粒后ESC和NSC中WNT4 mRNA表达水平。
　　6、Western Blotting检测转染WNT4重组质粒及WNT4 RNA干扰质粒后ESC和NSC中WNT4蛋白表达水平。
　　7、CCK-8细胞增殖实验检测WNT4基因表达改变前后各组细胞增殖能力的改变。
　　8、应用AnnexinⅤ-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒检测WNT4基因表达改变前后各组细胞凋亡率的改变。
　　9、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测WNT4表达改变前后MMP-9在培养上清中的含量变化。
　　结果:
　　一、WNT4在子宫内膜异位症异位病灶及在位内膜中的表达
　　1、Real time PCR结果显示，将对照组子宫内膜WNT4 mRNA相对表达水平的平均值设为1，相对于此平均值，内异症组在位内膜(EMs)和异位病灶(Ec)中WNT4 mRNA相对表达水平(2-ΔΔCt)分别为0.64±0.07(P＜0.01)和0.62±0.05(P＜0.01)，明显低于对照组子宫内膜1.04±0.12，差异具有统计学意义。内异症组增殖期(PE)和分泌期(SE)内膜WNT4 mRNA相对表达水平分别与对照组增殖期和分泌期内膜比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。内异症组在位内膜和异位病灶中WNT4 mRNA表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　2、免疫组化实验表明WNT4在子宫内膜组织的腺体和间质细胞都表达，内异症在位内膜和异位内膜WNT4蛋白表达阳性率分别为36.7％和30.0％，明显低于对照组子宫内膜，66.7％(P＜0.05)。内异症组增殖期和分泌期在位内膜WNT4蛋白表达阳性率明显低于对照组增殖期和分泌期子宫内膜(P＜0.05)。内异症在位内膜和异位内膜WNT4蛋白表达阳性率差别无统计学意义，同组内增殖期和分泌期比较差别无统计学意义(P＞0.05)。
　　3、Western blotting结果显示:将对照组子宫内膜WNT4蛋白相对表达水平的平均值设为1，相对于此平均值，内异症在位内膜组(EMs)和异位病灶(Ec)WNT4蛋白相对表达水平分别为0.60±0.13和0.62±0.10，低于对照组子宫内膜1.00±0.14(P＜0.05)。内异症组增殖期(PE)和分泌期(SE)内膜WNT4蛋白相对表达水平分别与对照组增殖期和分泌期内膜比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。内异症组在位内膜和异位病灶中WNT4蛋白表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　二、WNT4基因在子宫内膜异位症在位内膜间质细胞(ESC)中的表达及对其生物学活性的影响作用
　　1、体外成功分离和培养了子宫内膜异位症在位内膜间质细胞(ESC)及正常内膜间质细胞(NSC)。
　　2、免疫细胞化学染色鉴定结果表明细胞波形蛋白染色阳性，CD10染色阳性，角蛋白、Ⅷ因子及白细胞共同抗原染色均阴性，证实为子宫内膜间质细胞。
　　3、构建了三个靶向WNT4基因的shRNA表达载体pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3及pEGFP-N1-WNT4重组质粒。
　　4、实时荧光定量PCR结果显示:基础状态下，ESC组WNT4 mRNA相对水平（2-ΔΔCt，0.67±0.04）明显低于NSC组（1.02±0.11），P＜0.01。ESC转染pEGFP-N1-WNT4质粒组WNT4 mRNA相对水平为0.94±0.11，显著高于ESC组(P＜0.05)。ESC转染pEGFP-N1-V质粒组WNT4 mRNA相对水平为0.66±0.06，与ESC组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3组WNT4 mRNA相对水平分别为0.55±0.06、0.71±0.07和0.70±0.06，与NSC组比较明显降低(P＜0.05)。其中pGCsi-WNT4-s1组WNT4mRNA相对水平最低(P＜0.01)。 NSC转染pGCsi-V质粒组WNT4 mRNA相对水平为0.99±0.11，与NSC组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　5、蛋白免疫印迹结果显示:基础状态下，ESC组WNT4蛋白相对水平（WNT4/GAPDH，0.51±0.10）显著低于NSC组（1.00±0.16），P＜0.05。ESC转染pEGFP-N1-WNT4质粒组WNT4蛋白相对水平为0.94±0.11，显著高于ESC组(P＜0.05)。ESC转染pEGFP-N1-V质粒组WNT4蛋白相对水平为0.53±0.09，与ESC比较差异无统计学意义(P＞0.05)。pGCsi-WNT4-s1、pGCsi-WNT4-s2和pGCsi-WNT4-s3组WNT4蛋白相对水平分别为0.51±0.10、0.61±0.11和0.60±0.12，与ESC组比较明显降低(P＜0.05)。其中pGCsi-WNT4-s1组WNT4蛋白相对水平最低。NSC转染pGCsi-V质粒组WNT4蛋白相对水平为1.05±0.17，与NSC组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　6、CCK-8细胞增殖实验绘制细胞生长曲线显示:基础状态下，ESC组在24h、48h、72h和96h各个时间点的相对增殖能力明显高于NSC组相应各时间点的增殖能力(P＜0.05)。上调ESC WNT4基因表达即ESC转染pEGFP-N1-WNT4质粒后，ESC在48h、72h和96h各个时间点的相对增殖能力明显降低，明显低于ESC组对应各时间点的增殖能力(P＜0.01)。ESC转染空质粒组（pEGFP-N1-V）在24h、48h、72h和96h各个时间点的相对增殖能力与ESC组相应各个时间点增殖能力比较差别无统计学意义(P＞0.05)。使NSC WNT4基因沉默即转染pGCsi-WNT4-s1质粒后，48h、72h和96h各个时间点的细胞相对增殖能力明显升高，与NSC组对应各时间点的增殖能力比较(P＜0.01)。NSC转染空质粒组在24h、48h、72h和96h各个时间点的相对增殖能力与NSC组相应各个时间点增殖能力比较差别无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:
　　1、WNT4基因在正常子宫内膜的增殖期和分泌期均有表达，内异症异位病灶及在位内膜中WNT4表达水平明显低于对照组子宫内膜，WNT4的异常表达可能参与了内异症发生发展。
　　2、WNT4基因在内异症在位内膜间质细胞中表达下调，可以使内膜细胞增殖、侵袭能力增强，并抑制了细胞凋亡，WNT4基因表达下调可能通过改变子宫在位内膜细胞的生物学特性参与子宫内膜异位症的发生。

目录

声明

摘要

·论文一· WNT4在子宫内膜异位症异位病灶及在位内膜中的表达意义

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

·论文二· WNT4基因在子宫内膜异位症在位内膜细胞中表达及对其生物学行为的影响作用

前言

材料及方法

结果

讨论

结论

·本研究创新性的自我评价·

参考文献

·综述· WNT信号转导通路及其在子宫内膜异位症中的研究进展

·在学期间科研成绩·

致谢

·个人简介·