HDGF和ADAM9对肝癌HepG2细胞增殖侵袭能力的影响及其相互调控关系研究

摘要

目的：
　　原发性肝癌(primary liver cancer)是较为常见的消化系统恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤的第五位，死亡率极高，在恶性肿瘤死亡率排名中居第三位，仅次于胃癌、食道癌。我国是肝癌高发地区，每年死亡人数约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％左右。导致肝癌发病的因素包括病毒性肝炎、肝硬化、真菌及黄曲霉素、遗传因素等，这些致癌因素通过促发癌基因的过度表达、抑癌基因丢失或突变，最终引发肝癌的发生。肝癌衍生生长因子(hepatoma-derived growth factor，HDGF)是最早从人肝癌细胞系HuH-7的条件培养基中分离得到的一种酸性肝素结合蛋白，是一种阳离子多肽，其结构与bFGF相关，基因分子量为18.5～19.5KD。目前研究表明，HDGF在许多正常组织中呈低表达或不表达，而在肝癌、肺癌和胃癌等恶性肿瘤中显著高表达，肿瘤的恶性程度越高，HDGF的表达强度也越高，因此HDGF有望成为一种新的预测肝癌及其它恶性肿瘤侵袭、转移及预后的分子标志物和治疗靶点。
　　本研究的目标是首先探讨HDGF与ADAM9在肝癌、癌旁组织及正常对照肝组织中的表达情况，了解其表达相互关系。然后采用siRNA方法抑制HDGF及ADAM9基因的表达，研究HDGF在HepG2肝癌细胞中的作用和对ADAM9的表达影响，最后检测下调表达HDGF和ADAM9后HepG2细胞的增殖和侵袭能力，并一步探讨HDGF与ADAM9在肝癌生长、侵袭、转移等过程中可能发挥的作用。
　　方法：
　　本研究收集了32名肝癌患者的肿瘤组织与其癌旁组织标本，以及14例肝血管瘤患者的肝组织，利用Trizol方法提取总RNA。此外，利用同样的方法提取了HepG2细胞的总RNA。随后，将总RNA逆转录成cDNA，使用实时荧光定量PCR方法检测了HDGF和ADAM9在肝癌、癌旁、正常肝组织及HepG2细胞中的表达情况。随后应用Western blot技术检测了其在蛋白水平的表达情况。进一步实验中，利用Invitrogen公司在线网站设计了分别针对HDGF和ADAM9基因的特异shRNA片段，然后将其各自构建到pGPU6/GFP/NEO表达载体上，测序确定序列是否完全正确。随后，利用Lipofectamin2000将二者分别转染到HepG2细胞中，利用G418进行阳性克隆细胞筛选，14天后，在培养板中出现了单克隆细胞。随后对这些细胞扩大培养，并提取这些细胞的总RNA，逆转录成cDNA后，应用实时荧光定量PCR方法检测细胞中HDGF和ADAM9的基因表达以确定干扰效率。Western blot确证干扰HDGF和ADAM9基因后蛋白表达水平。随后，利用MTT法检测HDGF和ADAM9基因下调表达后细胞增殖情况;最后，利用Transwell小室检测HDGF和ADAM9基因被干扰下调后细胞侵袭能力的改变。
　　结果：
　　利用常规的TrizoI方法，成功的提取了肝癌、癌旁、正常肝组织及HepG2细胞的总RNA并反转录为cDNA。实时荧光定量PCR检测发现，肝癌组织及HepG2细胞中，HDGF和ADAM9基因的mRNA表达量都明显高于癌旁组织。Western blot检测结果与实时荧光定量PCR结果一致。接下来，本研究构建了特异性靶向抑制HDGF和ADAM9基因的表达载体——pGPU6/GFP/NEO-HDGF和pGPU6/GFP/NEO-ADAM9，序列分析表明完全正确。随后转染表达载体至HepG2细胞中，建立稳定表达shRNA-HDGF和shRNA-ADAM9的细胞株。实时荧光定量PCR检测单克隆细胞株HepG2-shRNA-HDGF的HDGF mRNA表达抑制效率为93％;单克隆细胞株HepG2-shRNA-ADAM9的ADAM9 mRNA表达抑制效率为90％。HepG2-shRNA-HDGF细胞株的ADAM9基因表达量也受到抑制，抑制效率达88％，而HepG2-shRNA-ADAM9细胞株中HDGF的表达变化不明显。Westernblot分析HDGF和ADAM9蛋白表达水平，与定量PCR结果相符。用MTT方法分析细胞增殖能力发现，HepG2-shRNA-HDGF和HepG2-shRNA-ADAM9的生长曲线明显低于对照组shRNA-Control和未转染HepG2细胞;细胞侵袭实验发现HepG2-shRNA-HDGF和HepG2-shRNA-ADAM9侵袭能力也明显低于对照组shRNA-Ctr和未转染HepG2细胞。
　　结论：
　　HDGF和ADAM9于肝癌组织和HepG2细胞中高表达。特异性靶向干扰HDGF和ADAM9基因表达在HepG2细胞中的表达，导致了HepG2细胞的增殖和侵袭能力明显减弱。HDGF基因的表达下调明显抑制ADAM9的表达，提示HDGF分子可能通过调节ADAM9起到其生物学作用。而ADAM9同HDGF一样，有可能成为肝癌基因治疗一个候选的靶标。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

技术路线

第一部分 HDGF和ADAM9在肝癌组织及HepG2肝癌细胞中的表达

材料与方法

实验结果

第二部分 siRNA稳定靶向抑制HDGF／ADAM9表达的HepG2肝癌细胞株的建立及鉴定

材料与方法

实验结果

第三部分 siRNA靶向抑制HDGF／ADAM9表达对HepG2细胞增殖侵袭能力的影响

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 HDGF在恶性肿瘤中的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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