异氟醚后处理诱导Slit/Robo信号表达抑制氧糖剥夺大鼠皮质神经元凋亡的研究

摘要

背景：研究表明脑缺血再灌注损伤引起的神经元死亡通过凋亡和坏死两种途径。延迟性的细胞死亡既凋亡是脑缺血再灌注后神经元死亡的重要方式。脑缺血再灌注后神经元凋亡的发生机制与凋亡相关基因被激活、被调控后细胞凋亡信号转导通路被启动有关。阐明脑缺血再灌注后神经元发生凋亡的机制以及寻找药物有效阻断脑缺血再灌注后凋亡的发生、发展是一项迫切而又有意义的工作。
　　 Slit作为一种分泌性的多肽蛋白，在轴突的排斥性引导和神经元的迁移中发挥着重要作用。同时还有研究表明，Slit参与了白细胞的趋化排斥作用，抑制炎症的发生发展，这种保守的排斥作用可以作用在多种细胞中。最近有文章报道Slit对脑缺血再灌注的大鼠模型以及混合培养的神经元-神经胶质细胞氧糖剥夺模型具有保护作用，可以减少神经元和/或神经胶质细胞的凋亡。
　　 已有研究证明吸入性麻醉药异氟醚具有脑保护作用，减少脑缺血再灌注后神经元的凋亡。公认的吸入性麻醉药异氟醚，其脑保护机制与降低缺血后脑组织的代谢和扩张脑血管、抑制自由基的合成和脂质过氧化反应，以及对神经递质的调控等因素有关。那么吸入麻醉药物是否可以增加Slit及其受体Robo信号机制的表达，从而发挥其脑保护作用呢？目前还没有研究来证实这些问题。
　　 基于上述原因，本研究建立了模拟机体脑缺血再灌注损伤的原代培养大鼠皮质神经元氧糖剥夺模型，选择应用于临床多年的吸入麻醉药异氟醚对氧糖剥夺的神经元进行干预。在此基础上，观察异氟醚后处理对氧糖剥夺的神经元进行干预后神经元中Slit2、Robo1、Robo4蛋白含量的变化和神经元损伤凋亡情况的检测，研究异氟醚后处理保护作用与Slit/Robo信号机制的关系。
　　 材料与方法：
　　 一、实验材料
　　 CO2培养箱(thermo，美国);低氧细胞培养箱(thermo，美国);倒置显微镜(Olympus，日本);Ohmeda气体监测仪(Exeel210，美国);微量注射泵（浙江浙大医学仪器有限公司，中国）;CCK8试剂盒、即用型SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，中国）;96孔和6孔无菌培养皿(Biofil，加拿大);高糖型(4.59/L) DMEM培养液、无糖型DMEM培养液(Hyelone，美国)，胎牛血清(FBS，Hyclone，美国)，多聚赖氨酸(Sigma Aldrich，美国)，B27(Invitrogen，美国);Neurobasal无血清培养液(Invitrogen，美国)，0.125％胰蛋白酶(HyClone，美国);NSE抗体（武汉博士德生物工程有限公司）;异氟醚（雅培公司，美国）;快速筛选型电泳系统(BIO-RAD，美国);SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，RIPA buffer（碧云天生物技术研究所，中国）;高速离心机(thermo，美国);Slit2（多肽蛋白，R&D，美国）、Robo1-Fc(Robo1单克隆抗体)、Robo4-Fc(Robo4单克隆抗体)、anti-Slit2（多克隆抗体）、anti-Robo1（多克隆抗体）、anti-Robo4（多克隆抗体）、caspase-3（多克隆抗体）(Santa Cruz，美国)。
　　 二、实验方法
　　 将培养7d的皮质神经元随机分为10组(n=10):正常培养组（C组）、OGD组(D组)、OGD+异氟醚组（I组）、OGD+Slit2组（S组）、OGD+R1组(R1组)、OGD+R4组(R4组)、OGD+异氟醚+R1组(IR1组)、OGD+异氟醚+R4组(IR4组)、OGD+Slit2+R1组(SR1组)、OGD+Slit2+R4组(SR4组)。C组神经元作为对照组，按正常培养方法培养。D组进行氧糖剥夺模型处理6小时后复糖复氧24小时。I组在进行氧糖剥夺后复氧前接受2h异氟醚麻醉（气体浓度2％）。S组、SR1组和SR4组均加入Slit多肽蛋白(浓度为1μg/L)。R1组、IR1组和SR1组加入Robo1-Fc(Robo1单克隆抗体，浓度为1nmol/L)，R4组、IR4组和SR4组加入Robo4-Fc(Robo4单克隆抗体，浓度为1nmol/L)。I组、R1组、R4组、IR1组、IR4组、S组、SR1组、SR4组的氧糖剥夺处理同D组。IR1组、IR4组接受的异氟醚后处理同I组。在96孔培养板培养7d的神经元随机分到各组，进行细胞存活率检测。6孔培养板培养7d的神经元随机分到各组，进行神经元纯度鉴定、神经元存活数目检测、神经元损伤检测以及细胞凋亡蛋白caspase-3、Slit2、Robo1、Robo4的免疫印记检测。
　　 结果：
　　 1、通过CCK8细胞活性检测，S组(Slit2处理组)和I组（异氟醚后处理组）的活性率明显高于D组（氧糖剥夺组），但低于C组（对照组）(P＜0.05)。S组低于I组的活性率(P＜0.05)。IR1组（异氟醚后处理和Robo1-Fc处理组）的活性率低于I组(P＜0.05)，IR4组（异氟醚后处理和Robo4-Fc处理组）的活性率与I组比较无显著性差异(P＞0.05)。 SR1组(Slit2处理和Robo1-Fc处理组)的活性率低于S组(P＜0.05)，SR4组(Slit2处理和Robo4-Fc处理组)的活性率与S组比较无显著性差异(P＞0.05)。
　　 通过LDH细胞损伤检测，S组和I组的损伤程度明显低于D组，但高于C组(P＜0.05)。S组高于I组的损伤程度(P＜0.05)。IR1组的损伤程度高于I组(P＜0.05)，IR4组的损伤程度与I组比较无显著性差异(P＞0.05)。SR1组的损伤程度高于S组(P＜0.05)，SR4组的损伤程度与S组比较无显著性差异(P＞0.05)。
　　 通过western-blotting免疫蛋白印记技术，检测了C组、D组、S组和I组神经元中凋亡蛋白caspase-3的表达。其中，进行氧糖剥夺的D组神经元中，凋亡蛋白caspase-3的活性片段19kDa的表达显著高于对照组C组、给予Slit多肽蛋白的S组和给予异氟醚后处理的I组(P＜0.05)。而S组、I组在凋亡蛋白caspase-3的活性片段19kDa的表达，高于C组(P＜0.05)。S组与I组比较， I组低于S组(P＜0.05)。
　　 通过western-blotting免疫蛋白印记技术，检测了C组、D组和I组中神经元Slit2、Robo1、Robo4蛋白表达的含量，发现经异氟醚干预的神经元即I组中，Slit2、Robo1表达含量均比D组中表达含量增加(P＜0.05)，但是Robo4的表达含量变化没有统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 1、 Slit2通过激动Robo1受体能够减少氧糖剥夺模型中原代培养大鼠皮质神经元的损伤及凋亡。
　　 2、异氟醚后处理能够减少氧糖剥夺模型中原代培养大鼠皮质神经元的损伤及凋亡。这种保护作用可能与异氟醚后处理增加Slit/Robo信号表达相关。

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