烟草细胞与发状根培养体系的建立及辅酶Q生物合成研究

摘要

本试验以烟草品种中烟98、中烟99、中烟100、心叶烟、NC89、K326等为试材，开展了以烟草细胞悬浮和发状根培养技术为手段，以生物转化方式生产辅酶Q<,10>为最终目的的实验室研究，以期为今后应用烟草植物细胞和发状根培养技术大规模生产辅酶Q<,10>提供理论依据。 1.本试验研究了6个烟草品种(中烟98、中烟99、中烟100、心叶烟、NC89、K326)的叶片和根系的辅酶Q<,10>含量。结果表明：在烟草幼苗叶片中，以中烟98辅酶Q。。含量最高，NC89次之，心叶烟最低；在烟草幼苗根系中，以中烟99辅酶Q<,10>含量最高，NC89和心叶烟次之，K326最低；中烟99、中烟100、K326、NC89、心叶烟等5个品种的根系辅酶Q<,10>含量均明显高于其叶片中辅酶Q<,10>的含量。 2.进行了烟草辅酶Q<,10>分离、提取方法的优化和比较。乙醇浸提法中，乙醇浓度90％、料液比1：20，回流温度70℃、回流时间120 min为最佳提取方法；丙酮研磨法中，料液比1：3、正己烷萃取的效果最佳；碱皂化法的最佳提取条件为：酸消解pH值为3，料液比为1：10，80℃回流90min时，碱皂化处理pH为11，料液比1：15，回流温度100℃，回流时间：30min时，辅酶Q<,10>含量最高。丙酮研磨正己烷萃取法工艺相对简单，提取效率高，适合辅酶Q<,10>含量的初步测定。 3.以辅酶Q<,10>含量较高的NC89烟草品种为试材，采用烟草细胞悬浮培养技术，对影响烟草细胞生长和辅酶Q<,10>形成的最佳理化条件进行了选择与优化。 (1)通过改变激素配比和培养条件等策略，获得了适合液体悬浮培养的愈伤组织。其中，加入激素NAA和6-BA的MS培养基比加入激素2，4-D和KT的MS培养基更适合诱导烟草愈伤组织的产生；最适继代培养基为MS+NAA 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+3％蔗糖+0.7％琼脂；光照培养比暗培养更适合烟草愈伤的继代培养。 (2)建立了快速生长的烟草细胞系，通过筛选温度、接种量及激素配比等优化了悬浮培养条件。25℃是适合烟草细胞生长和辅酶Q<,10>合成的温度；细胞最适接种量为3～4g；最适液态培养基激素配比为NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.8 mg/L。蔗糖浓度和pH值会影响烟草细胞生长和辅酶Q<,10>形成。蔗糖浓度为3％左右时细胞增长快，细胞生物量大，有利于辅酶Q<,10>积累，辅酶Q<,10>总量高；pH值为5.8～6.4.时适于烟草细胞生长和辅酶Q<,10>合成。 (3)比较了几种植物生长调节剂对烟草细胞生长和辅酶Q<,10>含量的影响。其中，低浓度IAA对细胞生长和辅酶Q<,10>含量均无明显影响，但IAA浓度大于2.0 mg/L时，会抑制细胞生长和辅酶Q<,10>形成；2，4-D使细胞生物量有一定程度的降低，但却能提高辅酶Q<,10>含量，其中2，4-D浓度为0.5 mg/L，辅酶Q<,10>总量高达7.639 mg/L，与对照相比提高了24.27％；KT浓度为0.5 mg/L时，可提高细胞生物量，但辅酶Q<,10>总量变化不明显，KT浓度大于2.0 mg/L时，则对细胞生长不利，辅酶Q<,10>含量有所下降。 (4)研究了几种有机物质和前体物质对烟草细胞生长和辅酶Q<,10>形成的影响。盐酸硫胺素浓度为4.0 mg/L时，细胞干重、辅酶Q<,10>含量及总量最高，分别为23.873g/L、343 μg/g、和8.176 mg/L；L-苯丙氨酸为2.0 mg/L时，对烟草细胞生长没有明显影响，但对辅酶Q<,10>形成有一定的促进作用，最大增幅为22.13％；对羟基苯甲酸浓度低于5.0mg/L时，对烟草细胞生长无明显影响，但可促进辅酶Q<,10>的形成，最大增幅达19.85％；添加L-酪氨酸对细胞生长和辅酶Q<,10>的形成作用不明显。 (5)研究了生长素IAA与几种营养和前体物质正交实验对辅酶Q<,10>合成的影响。最适营养条件为IAAO.5mg/L+盐酸硫胺素4.0mg/L+L-苯丙氨酸1.0mg/L+对羟基苯甲酸5.0mg/L和IAA0.5mg/L+盐酸硫胺素4.0mg/L+L-苯丙氨酸2.0mg/L+对羟基苯甲酸2.0mg/L。 4.利用发根农杆菌ATCC15834菌株在烟草外植体上直接诱导产生发根，在MS固体培养基上建立起发根离体培养系；通过形态结构观察判断法和PCR法检测烟草发状根中发根农杆菌Ri质粒致根基因的转化情况；并就悬浮培养中有利于发状根生长及辅酶Q<,10>合成的影响因子进行了初步的研究。 (1)发根农杆菌转化烟草形成发状根的效率，受发根农杆菌种类、浓度、及烟草品种、叶片发育时期、叶片在菌液中浸泡时间、共培养时间及外源加入不同生长激素等多种因素的影响。采用处于对数生长期的ATCC15834：菌株感染中烟99无菌苗幼嫩叶圆片5min，在pH值5.8的添加0.1mg/L NAA的MS培养基上共培养2d，可达最大转化效率69.35％。 (2)通过发状根形态结构观察发现发状根没有分化出典型的根冠结构；PCR扩增结果表明，发根农杆菌Ri质粒的rol B基因560bp的特异性DNA片段已在烟草发根基因组中整合并得到表达。 (3)在MS固体培养基上建立起发根离体培养系，经连续多代的培养，发根仍保持旺盛生长状态。悬浮培养中烟草发状根的生长及辅酶Q<,10>合成受到基本培养基类型、初始pH值、蔗糖浓度、装液量及激素种类和浓度等因素的影响。1/2 MS培养基，蔗糖20～30g/，DH 6.4，装液量为40mL/100mL是适合烟草发状根液体培养的条件；适当浓度的植物生长调节剂有利于促进发状根生长，增加辅酶Q<,10>积累量，其中工AA浓度为0.5 mg/L、NAA浓度为0.2mg/L、赤霉素GA<,3>浓度为0.5mg/L时，辅酶Q<,10>含量增幅分别为62.26％、23.14％和68.26％。

目录

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摘要

第一章文献综述

1.1引言

1.2植物细胞培养技术生产次生代谢产物的研究历史及现状

1.3植物细胞培养技术生产次生代谢物的增产策略

1.4发状根培养技术的应用

1.5固定化培养技术和生物转化研究

1.6植物次生代谢产物的分离纯化

1.7辅酶Q10的研究现状及前景

1.8植物细胞培养技术应用前景

1.9小结

1.10研究工作设想

第二章几个烟草品种辅酶Q10含量的比较

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1供试材料

2.2.2实验方法

2.3结果与分析

2.3.1不同品种烟草幼苗叶片中辅酶Q10含量的比较

2.3.2不同品种烟草幼苗根系中辅酶Q10含量的比较

2.3.3不同品种烟草幼苗叶片和根系中辅酶Q10含量的比较

2.4结论与讨论

2.4.1小结

2.4.2讨论

第三章烟草辅酶Q10的分离提取

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1供试材料

3.2.2提取方法

3.2.3测定方法

3.3结果与分析

3.3.1几种溶剂提取辅酶Q10粗提物含量的初步比较

3.3.2乙醇浸提法提取条件的优化

3.3.3丙酮研磨提取法提取条件的优化

3.3.4碱皂化法提取条件的优化

3.3.5优化后提取方法的辅酶Q10含量比较

3.4结论与讨论

3.4.1小结

3.4.2讨论

第四章烟草细胞悬浮培养体系建立及其生产辅酶Q10的研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1供试材料

4.2.2实验方法

4.2.3测定方法

4.3结果与分析

4.3.1烟草愈伤组织诱导及悬浮细胞系建立

4.3.2辅酶Q10形成的影响因素及含量测定

4.4结论与讨论

4.4.1小结

4.4.2讨论

第五章Ri质粒转化的烟草发状根培养及其辅酶Q10合成调控的研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1供试材料

5.2.2实验方法

5.2.3测定方法

5.3结果与分析

5.3.1烟草发状根的诱导及筛选

5.3.2烟草发状根的鉴定

5.3.3发状根液体培养体系建立及生产辅酶Q10的条件研究

5.4结论与讨论

5.4.1小结

5.4.2讨论

创新点摘要

参考文献

致谢

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