桃儿七离体培养体系的建立与发状根诱导研究

摘要

桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum（Royle）Ying）是小檗科（Berberidaceae）鬼臼亚科（Podophylloideae）桃儿七属多年生草本植物。其根和根茎中含有的鬼臼毒素，是合成抗癌药物的重要原料来源。随着人们生活水平与质量的不断提高，对抗癌药物的需求也日益增大，对桃儿七资源的需求量也不断增加。由于桃儿七生长缓慢、对生长环境要求高、分布区域狭小，野生资源稀缺，导致市场紧俏。加之近年来大量人工挖掘以及人工栽培困难，使桃儿七资源面临濒危境地，目前已被列入《中国珍稀濒危植物名录》，国家三级保护植物。因此，利用植物细胞工程技术的原理与方法，人工繁殖桃儿七并进行“鬼臼毒素”的工业化生产，具有重要的理论与实践意义，被普遍认为是一条有效保护与利用桃儿七这一濒危稀缺资源，缓解“鬼臼毒素”市场需求的一条重要的新途径。本实验以桃儿七种胚为材料，通过对无菌苗诱导及培养方法的优化，建立了高效、稳定的种胚培养体系，并以桃儿七种胚和抱窝磷茎为受体，利用发根农杆菌2100转化诱导毛状根研究，以期建立桃儿七毛状根培养体系和筛选高含量“鬼臼毒素”培养系的研究。主要取得如下研究结果：
　　 ⑴桃儿七种胚离体培养最佳培养基MS+IAA0.5mg/L+KT0.2mg/L+GA30.3mg/L，诱导率达到98.34％。22℃低温和全天候光照最适于桃儿七无菌苗的诱导，有效降低褐化率。继代培养最佳培养基MS+对苯二酚0.5mg/I+AC0.5 mg/l，抱窝鳞茎增多，根逐渐生长变粗，有效解决了无菌苗细弱，生根难的问题。1-5mg/L对苯二酚与0.5mg/LAC对桃儿七无菌苗生根培养具有明显促进作用。添加适宜浓度的AC明显降低种胚的褐化率，有效提高诱导率；创造的黑暗环境有利于根的诱导和根系的生长。
　　 ⑵本实验历时一年，以发根农杆菌R1000与2100为转化菌株，对转化受体、培养条件、转化方法进行多次对比调试，每种处理接种80粒，进行4次重复，最终以种胚为感染受体，预培养1天，用发根农杆菌2100菌液OD600值在0.2-0.4之间侵染15分钟，共培养1天，500mg/Lcef进行脱菌培养，侵染获得毛状根均在此条件下获得。光照有利于桃儿七毛状根的诱导，黑暗条件下转化的外植体均未诱导出毛状根。发根农杆菌2100转化桃儿七获得毛状根无向地性但生长缓慢，无多分枝，并不完全具备毛状根的典型特征，且诱导率极低，无法进行PER检测，不能确定即为发根农杆菌转化所得毛状根。
　　 ⑶为证实桃儿七发状根诱导的困难和验证所采用的转化方法的可靠性，用发根农杆菌2100对葡萄单芽茎段进行对照诱导实验，在茎段的基部产生了大量的毛状根系，呈黄白色，无向地性、多分枝、生长迅速等特点，具备毛状根的典型特征。经PCR检测，发根农杆菌含有的RiT-DNA的ro1C发根基因已整合进入葡萄基因组中，证明本实验所采用的毛状根诱导菌株与转化方法可行。
　　 ⑷鉴于桃儿七鬼臼毒素工业化生产的必要性，有必要继续深入发根农杆菌对桃儿七遗传转化的研究。下一步工作可以考虑通过物理化学的方法对转化外植体进行处理，提高其对发根农杆菌的敏感度；同时，对脱菌方法进行进一步摸索，提高除菌效果的同时减少对外植体的毒害。