慢性乙醇暴露小鼠脑神经细胞IP3R1表达变化的研究

摘要

目的：据报道世界卫生组织估计全世界有20多亿人饮用酒精性饮料及7.63亿人诊断为酒精性相关性疾病、紊乱症。有报道显示慢性乙醇中毒能产生永久的认知功能障碍而被认为是继阿尔茨海默病（AD）后引起的痴呆的第二大原因。慢性乙醇中毒具体机制还不明确，但有研究表明，慢性酒精中毒的发病机制与细胞凋亡有关。caspase-3被认为是凋亡的执行者，乙醇暴露可引起大鼠、小鼠脑神经细胞凋亡，caspase-3活性增强，表达增加，而caspase-3的激活与细胞内Ca+浓度的增加有关联。1，4，5-三磷酸肌醇受体(IP3R)是细胞内主要存在内质网的Ca2+释放通道，它与肌醇三磷酸(IP3)特异性结合后，促进细胞内Ca+迅速释放。乙醇能诱导细胞内Ca+浓度升高，研究显示乙醇增加胞内Ca+浓度可能来源于钙库释放，而胞浆Ca+浓度升高诱导细胞凋亡。本研究在建立小鼠慢性乙醇暴露的动物模型基础上，应用免疫组化和Western blot技术检测慢性乙醇暴露小鼠大脑皮质神经细胞IP3R1的表达变化，探讨慢性乙醇暴露小鼠大脑皮质神经细胞损伤的细胞凋亡机制。
　　 实验材料与方法：
　　 一、动物模型的建立及分组
　　 健康成年（8周龄）清洁级昆明系雄性小鼠40只，体重30～42g，由中国医科大学实验动物中心提供。适应性喂养5天后给予饮用矿泉水和不同浓度乙醇液体。随机分为90d正常对照组、10％、20％、30％乙醇实验组和180d正常对照组、10％、20％、30％乙醇实验组，每组5只动物。每日观察各组动物喂养情况及行为变化，每周测体重一次。至实验预计时间，乙醚吸入麻醉过量后迅速断头，剥离颅顶、枕部皮肤、肌肉和顶骨、枕骨，取出完整脑组织。
　　 二、实验方法
　　 应用免疫组化、Western blot等方法检查慢性乙醇暴露后小鼠大脑皮质神经细胞IP3R1表达的变化。免疫组化结果应用Motic Image Advanced3.2图像分析系统进行分析，以正常对照组小鼠大脑皮质作对照，显微镜×400倍下，在大脑皮质区随机选取10个视野，计数细胞总数、阳性细胞数及计算阳性细胞率。Western blot结果检测各组平均积分光密度值。用SPSS13.0 for Windows软件对组间实验数据进行单因素方差分析。
　　 结果：
　　 慢性乙醇暴露小鼠毛发失去光泽、杂乱、稀疏，精神萎靡、易激惹，体重增长缓慢，大脑质软，组织肿胀，脑沟变浅，H.E.染色显示皮质神经细胞嗜伊红染色增强，轴突肿胀，尼氏体边聚，脑实质内神经细胞、血管周间隙增宽，有的神经细胞核深染，染色质固缩，胞质浓缩，可见噬神经细胞现象。正常IP3R1免疫组化染色物分布于神经细胞胞质内。90d各实验组，随着乙醇浓度的增加，IP3R1免疫组化阳性细胞数和阳性细胞率逐步增加，组间比较，差异显著(P＜0.05);180d10％、20％乙醇实验组阳性细胞数和阳性细胞率逐步增加，组间比较，差异显著(P＜0.05);而30％乙醇实验组阳性细胞数和阳性细胞率反而减少，且低于相同浓度90d实验组(P＜0.05)。Western blot与免疫组化检查结果基本一致。
　　 结论：
　　 1、慢性乙醇暴露导致小鼠大脑皮质神经细胞IP3R1表达增强。
　　 2、慢性乙醇暴露导致小鼠大脑皮质神经细胞IP3R1表达增强的程度与饮酒时间及饮酒浓度相关，乙醇浓度越高，IP3R1表达的越多。但随着时间的延长，高浓度乙醇暴露IP3R1表达量反而有所减少，可能与神经细胞变性、坏死、数目减少有关。
　　 3、乙醇引起的细胞凋亡可能与乙醇诱导的IP3R1表达增强有关。

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