JNK/MAPK信号通路与NADPH氧化酶在氟致小胶质细胞氧化损伤中的作用研究

摘要

目的：
　　 氟是机体生命活动所必需的微量元素之一，但人体对氟的生理需要量很小，长期摄入过量的氟会引起氟中毒。氟中毒不仅会造成机体牙齿、骨骼等硬组织的广泛损伤，还可引起全身软组织不同程度的广泛损伤。近年来，一些现场调查研究发现，氟中毒病区儿童智力水平明显下降，氟对中枢神经系统的损伤受到关注，但其作用机制尚不清楚。
　　 目前氟的毒作用机制尚未完全明确，但由于脑组织中富含多不饱和脂肪酸，易受脂质过氧化损伤，脂质过氧化作用被普遍认为是氟的毒作用机制之一。
　　 小胶质细胞（Microglia, MG）广泛分布在中枢神经系统(Central nervoussystem，CNS)，约占胶质细胞数目的10％～20％，在神经元的生理活动中起着支持、营养、保护及修护等重要功能。MG一般处于静止状态，但对任何很小的中枢病理变化均可产生反应而激活，激活的MG对机体可产生有益的保护作用，如分泌生长因子、吞噬胶质细胞碎片、抵御外来抗原的侵袭等。但MG的过度激活可产生大量细胞因子及活性氧产物，其异常激活及其所诱导的炎症反应是多种环境因素所致中枢神经系统损伤的重要因素。活性氧(Reactive oxygen species，ROS)作为重要的第二信使参与调控丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinases，MAPK)信号转导通路，同时，MAPK信号通路活化后，又可经过几种激酶的活化产生更大量的ROS，促进氧化应激的发生。因此，本研究以MG为切入点，探讨氟是否可诱导小胶质细胞活化及其所致氧化损伤情况，了解MAPK通路在氟致小胶质细胞氧化应激中是否起作用，探索氟致中枢神经系统氧化损伤的机制。
　　 材料和方法：
　　 一、实验方法
　　 （一）细胞培养
　　 小胶质细胞系(BV-2)购自中国协和医科大学基础医学细胞中心。细胞常规培养于DMEM高糖培养基（含10％胎牛血清），5％ CO2、37℃条件下培养。
　　 （二）细胞增殖活力检测
　　 采用MTT比色法。实验分为对照组和6个染氟组，每组设置三个平行样。用酶标仪测定各孔的光密度(OD)值，细胞活力用还原率表示。还原率越高，表示细胞增殖活力越强。
　　 （三）IBA-1的细胞荧光免疫化学检测
　　 采用荧光免疫细胞化学方法，用荧光显微镜(×400)观察BV-2细胞活化后特异性标志物IBA-1的表达情况。细胞胞浆呈红色为阳性细胞。实验分组为对照组、染氟组。
　　 （四）细胞内ROS、O2·-的检测
　　 采用2’，7’-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)法，用FACScan流式细胞仪于488nm激发波长，525 nm发射波长处检测荧光强弱用来代表ROS的相对含量。实验分组为:对照组和不加染料DCFH-DA的对照组，即2个对照组和染氟组。
　　 采用DHE法，用FACScan流式细胞仪于300nm激发波长，610nm发射波长处检测荧光强弱用来代表O2·-的相对含量。实验分组为:对照组和不加染料DHE的对照组，即2个对照组和染氟组。
　　 使用NADPH氧化酶抑制剂API或者JNK抑制剂SP600125预处理细胞，之后加入NaF处理24 h，检测ROS、O2·-的相对含量。实验分组为:对照组，50 mg/LNaF组，50+API(50+SP600125)组。
　　 （五）细胞内NO的检测
　　 采用DAF-FM DA法，用FACScan流式细胞仪于495nm激发波长，515 nm发射波长处检测荧光强弱用来代表NO的相对含量。实验分组为:对照组和不加染料DAF-FM DA的对照组，即2个对照组和染氟组。
　　 使用iNOS抑制剂SMT预处理细胞，之后加入NaF处理24 h，检测NO的相对含量。实验分组为:对照组，50 mg/L NaF组，50+SMT组。
　　 （六）蛋白质免疫印迹法检测MAPK信号通路
　　 采用蛋白免疫印迹法对MAPK信号通路的主要蛋白激酶进行检测。
　　 （七）ELISA法检测细胞培养液中的TNF-α和IL-1β
　　 采用ELISA检测试剂盒检测细胞内TNF-α和IL-1β含量。实验分组为:对照组和染氟组。
　　 二、统计学处理
　　 用SPSS13.0统计软件进行统计分析，用Kolmogorov-Smirnov进行数据正态性分析。组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，用Levene Statistic进行方差齐性检验，两两比较采用LSD-t检验或Dunnett T3检验;相关分析用PearsonCorrelation或非参数相关。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、氟处理的BV-2细胞增殖活力变化
　　 用浓度为0、1、5、10、25、50、100mg/L的NaF，分别处理BV-2细胞6、12、24、48和72 h后，细胞增殖活力随着染氟浓度的增加而逐渐降低。但BV-2细胞染毒6h后，在1、5 mg/L NaF处理组，细胞增殖活力出现一个显著升高现象(P＜0.05)。
　　 2、氟化钠对BV-2细胞的活化作用
　　 分别用1、5、10、50、100mg/L的NaF染毒BV-2细胞24 h后，采用荧光免疫细胞化学方法，观察BV-2细胞活化后特异性标志物IBA-1的蛋白表达情况。结果显示，1-100 mg/L NaF染毒组处理24 h后，细胞胞浆中红色IBA-1蛋白表达增强。
　　 3、氟暴露对BV-2细胞释放炎性因子的影响
　　 BV-2细胞染毒12、24 h后，细胞内的NO含量随着氟暴露剂量增加显著升高。BV-2细胞染毒12h后，50、100 mg/L NaF处理组细胞内NO含量均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);BV-2细胞染毒24 h后，100 mg/L NaF处理组细胞内NO含量显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 BV-2细胞染毒12h后，50、100 mg/L NaF处理组细胞培养液中TNF-α含量均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01);BV-2细胞染毒24 h后，100 mg/LNaF处理组细胞培养液中TNF-α含量显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　 BV-2细胞染毒12、24 h后，1 mg/L NaF处理组细胞培养液中IL-1β含量显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4、氟暴露对BV-2细胞氧化损伤的影响
　　 BV-2细胞染毒3、6、12、24 h后，细胞内的ROS含量随着氟暴露剂量增加显著升高。BV-2细胞染毒12、24 h后，细胞内的O2·-含量随着氟暴露剂量增加显著升高。
　　 5、NADPH氧化酶(NOX)和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)在氟暴露引起的BV-2细胞氧化损伤中的作用
　　 与单独染氟组相比，NOX抑制剂API能够显著降低NaF诱导的BV-2细胞内ROS、O2·-含量;与单独染氟组相比，iNOS抑制剂SMT能够显著降低NaF诱导的BV-2细胞内NO含量（P＜0.01）。
　　 6、MAPK信号通路在氟暴露引起的BV-2细胞氧化损伤中的作用
　　 NaF能够引起BV-2细胞JNK蛋白磷酸化水平升高，抗氧化剂褪黑素能够部分降低氟引起的JNK磷酸化水平。JNK抑制剂能够显著降低氟暴露诱导的BV-2细胞内O2·-、NO含量（P＜0.01）。
　　 结论：
　　 1、一定剂量的氟能够引起小胶质细胞的活化；
　　 2、氟可以引起小胶质细胞氧化应激水平增高；
　　 3、JNK信号通路在氟引起的小胶质细胞氧化应激中起作用；
　　 4、小胶质细胞氧化应激能够激活JNK信号通路。

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